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1、人类胚胎干细胞5-羟甲基胞嚅咤识别蛋白 HMCESZ及大肠杆菌单链DNA吉合蛋白RecT的结构初探1.人类胚胎干细胞5-羟甲基胞喀呢识别蛋白HMCES结构初探表观遗传学修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等,其中DNA甲基化研究的最为 深入。由于在甲基化以及去甲基化过程中的重要作用，5-甲基胞嗡噬（5mC）被称为 第五种碱基,5-羟甲基胞喀呢（5hmC液称为第六种碱基。5mo TET酶进一步氧化为5hmCt,HMCES乍为一个5hmCR别蛋白，能通过 结合5hmCA而招募下游蛋白发挥功能，最终将5mC专换为普通的胞喀呢。在这个 过程中HMCES肽酶活性，能通过自剪切来调控下游信号。这也
2、是其独特之处。本实验首先在体外克隆了 HMCE的全长基因，构建了 HMCES-MEBP HMCES个载体，然后通过原核表达系统在体外进行了表达鉴定。我们首先对HMCES-MBP行了纯化，发现蛋白在TEVBB酶切之后降解消失， 因此我们又针对性地对 HMCES表达进行了优化，发现了 HMCESJ持续性降解现 象。通过质谱分析、二级结构预测等手段找到 HMCES定的酶解片段HMCES-276 之后，我们对HMCES-27又重新进行了克隆、表达与纯化。在解决了 HMCES-276勺聚合问题之后，经过多次优化，通过晶体初筛最终得到了晶体, 下一步衍射收到数据之后, 即可通过结构解析揭示其功能基础, 后
3、续的工作正在进展当中。2.大肠杆菌单链DNA吉合蛋白RecT的表达纯化外界环境和 细胞内部的诸多因素经常会导致 DN的子的损伤或改变。为了应对DNA!员伤，减小对细胞的影响，细胞在长期进化过程中，形成了多种 DNA伤的修复系统，包括光复活修复、碱基切除修复、核甘酸切除修复、重组 修复、SOS窗复、双链断裂修复等多种修复方式。其中重组修复途径在真核生物与原核生物中是不同的。在原核生物中，主要是通过Rec蛋白系列完成的，包括：RecABCDRecFO取 RecET RecT存在于大肠杆菌中,通过结合单链DNA与RecE互相作用来促进互补 的ssDNA复性。对于该部分的工作,我们试图通过结构生物学的方法阐明 RecT促进ssDNA 复性的结构基础。我们首先采用原核表达系统，对RecT进行体外克隆以及表达纯 化 , 但晶体筛选之后并没有得到晶体。我们又对初筛过程进行了优化，分别加入了稳定RecT的Mg2包及RecT的底 物ssDNAff育，仍然没有长出晶体。此时我们转换思路，尝试对RecT的截短片段 进行研究。我们分别克隆了 RecT的两个截短片段，但在纯化过程中发现，只有RecT (94-C)可以稳定表达，随后对RecT-C片段进行了晶体筛选，目前后续的优化正在 进行中，以期能拿到晶体通过X射线衍射晶体学的方法解析 RecT结构，揭示其是 如何发挥功能的。