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1、ELISA原理操作规那么新手适用点击次数：3347发布时间：2021-7-12 8:45:33ELISA原理-操作规那么新手适用酶联免疫吸附实验ELISAELISA法是免疫诊断中的一项新技术,现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断.也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定,根据已经使用的结果,认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点.不仅适用于临床标本的检查,而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本 , 因此,也适合于血清流行病学调查.本法不仅可以用来测定抗体,而且也可用于测定体液中的循环抗原,所以也是一种早期诊断的良
2、好方法.因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大,可概括四个方面：1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位.2、研究抗酶抗体的合成.3、显现微量的免疫沉淀反响.4、定量检测体液中抗原或抗体成份.一.实验目的酶联免疫吸附测定enzyme-linked immunosorbent assay 简称 ELISA 是在 免疫酶技术immunoenzymatic techniques的根底上开展起来的一种新型的免 疫测定技术,ELISAd程包括抗原抗体吸附在固相载体上称为包被,加待测抗 体抗原,再加相应酶标记抗体抗原,生成抗原抗体-待测抗体抗 原-酶标记抗体的复合物,再与该酶的底物反响生成有色产物.
3、借助分光光 度计的光吸收计算抗体抗原的量.待测抗体抗原的定量与有色产生成正 比.二.实验原理用于免疫酶技术的酶有很多,如过氧化物酶,碱性磷酸酯酶,B -D-半乳 糖甘酶,葡萄糖氧化酶,碳酸酊酶,乙酰胆碱酯酶,6-磷酸葡萄糖脱氧酶等.常用于ELISAt的酶有辣根过氧化物酶,碱性磷酸酯酶等,其中尤以辣根过氧化 物酶为多.由于酶摧化的是氧化复原反响,在呈色后须马上测定,否那么空气中的 氧化作用使颜色加深,无法准确地定量.辣根过氧化物酶(HRP是一种糖蛋白,每个分子含有一个氯化血红素 (protonhemin)区作辅基.酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示.氯化血红素 辅基的最大吸收峰是403nm, HR
4、PW蛋白的最大吸收峰是275nm,所以酶的浓 度和纯度计算式是( HRP的A (1cm 403nm 1% =25,式中1%指HRP百 分浓度为100ml含酶蛋白1g,即10mg/ml,所以,酶浓度以mg/ml计算是HRP 的 A (1cm 403nm mg/ml=) HRP纯度(RZ =A403nm/A275nm 纯度 RZ (R einheit Zahl)值越大说明酶内所含杂质越少.高纯度 HRP的RZ值在左右,最高可达. 用于ELISA佥测的HRP的RZ值要求在以上.ELISA勺根本原理有三条：(1)抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体外表,可能是蛋白和聚苯乙烯 外表间的疏水性局部相互吸附
5、,并保持其免疫学活性；(2)抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能 保持其免疫学和酶学活性；(3)酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据参加底物的颜色反响来判定 是否有免疫反响的存在,而且颜色反响的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成 正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果.三、实验方法1 10g/ml.在1 .包被：用PH9釉碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为每个聚苯乙烯板的反响孔中加,4c过夜.次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟.简称洗涤,下同.2 .加样：加一定稀释的待检样品于上述已包被之反响孔中,置37c孵育1小时.然后洗涤.同时做
6、空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔.3 .加酶标抗体：于各反响孔中,参加新鲜稀释的酶标抗体 经滴定后的稀释度.37 c 孵育1小时,洗涤.4 .加底物液显色：于各反响孔中参加临时配制的TMB底物溶液,37c 1030分钟.5 .终止反响：于各反响孔中参加2M硫酸.6 .结果判定：可于白色背景上,直接用肉眼观察结果：反响孔内颜色越深,阳性程度 越强,阴性反响为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+、-号表示.也可测 O D值：在ELISA检测仪上,于450nm 假设以ABTS显色,那么410nm处,以空白对照孔调零后 测各孔O-D值,假设大于规定的阴性对照 OD值的倍,即为阳性.根本方法二用于检测未
7、知抗体的间接法：用包被缓冲液将抗原稀释至110科g/ml,每孔加,4c过夜.次日洗涤 3次.加一定稀释的待检样品未知抗体于上述已包被之反响孔中,置37c孵育1小时,洗涤.同 时做空白、阴性及阳性孔对照于反响孔中,参加新鲜稀释的酶标第二抗体抗抗体,37c孵育30-60分钟,洗涤,最后一遍用DDW洗涤.二酶与底物酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物.是 ELISA 成败的关键试剂,它不仅具有抗体抗原特异的免疫反响, 还具有酶促反响,显示 出生物放大作用,但不同的酶选用不同的底物.免疫技术常用的酶及其底物酶底物显色反响测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺橘红色492*四甲替联苯胺黄色4
8、60*氨基水杨酸棕色449邻联苯甲胺兰色4252,2/ -连胺基-2 3-乙基-并曝n坐咻磺酸-6镂盐蓝绿色642碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐PNP黄色400蔡酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐红色500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+萄糖黄色405,420葡萄糖+甲硫酚嗪+曝n坐兰深蓝色B-D半乳糖甘酶甲基伞酮基半乳糖甘4MuG荧光360,450硝基酚半乳糖甘ONPQ黄色420* 终止齐I为2mol/L H2SO4*终止剂为2 mol/L柠檬酸,不同的底物有不同的终止剂.可催化以下反响：HRP+H2O复合物复合物+AH2一过氧化物酶+H2O+A AH2 为无色底物,供氢体；A 为有色产物.三ELIS
9、A常用的四种方法1 .直接法测定抗原将抗原吸附在载体外表；加酶标抗体,形成抗原一抗体复合物；加底物.底物的降解量=抗原量.2 .间接法测定抗体将抗原吸附于固相载体外表；加抗体,形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物测定底物的降解量=抗体量.3 .双抗体夹心法测定抗原将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相外表 ；加抗原,形成抗原-抗体复合物；加抗原免疫第二种动物获得的抗体,形成抗体抗原抗体复合物；加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体)；加底物.底物的降解量=抗原量.4 .竞争法测定抗原将抗体吸附在固相载体外表；(1)参加酶标抗原；(2) , (3)参加酶标抗原和待测抗原；加底物.对照孔与样品孔
10、底物降解量的差=未知抗原量.三.仪器和材料1 .聚苯乙烯微量细胞培养板-酶标板(平板,40孔,96孔).2 .酶联免疫检测仪,50ul或100ul加样器.3 .辣根过氧化物酶羊抗兔IgG,工作稀释度1:1000.4 .包被液：L碳酸盐缓冲液,4 C保存.Na2CO3克,NaHCO3克,蒸储水稀 释至100 ml.5 .稀释液：同洗涤缓冲液.【或者牛血清白蛋白(BSA参加洗涤缓冲液至100ml;或者加羊/兔血清与洗涤液配成5-10%】6 .洗涤缓冲液：L PBS-Tween-20,于 4 c保存. NaCl 8g, KH2PO4 , Na2HPO412H2O , Tween-20 %.蒸储水力口
11、至 1000ml.7 .封闭液：鸡卵清蛋白,PBS8 .邻苯二胺溶液底物：临用前配制,柠檬酸100ml,Na2HP0412H2O 7 .163g/100ml,蒸储水,邻苯二胺10mg,溶解后,临用前加 30%H2O2 40u l9 .终止液：2mol/L H2SO4 蒸储水逐滴参加浓硫酸98%.四.操作步骤1 .包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释,一般为110微克/孔,每孔加 200微升,37c温育1小时后,4c冰箱放置1618小时.2 .洗涤：倒尽板孔中液体,加满洗涤液,静放三分钟,反复三次,最后将 反响板倒置在吸水纸上,使孔中洗涤液流尽.3 .加封闭液200微升,37 c放置一小时.4 .洗涤同2.5 .加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,每孔200微升.同时作 稀释液又1照.37c放置2小时.6 .洗涤同2.7 .加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG,每孔200微开,放置37c 1小时.8 .洗涤同2.9 .加底物：邻苯二胺溶液加200ml,室温暗处1015分钟.10 .加终止液：每孔50微升.11 .观察结果：用酶联免疫检测仪记录 490nm读数.