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1、Chapter 5 固定化技术及其应用 Section 1 固定化技术1、发展历史： 1953年，德国的格鲁布霍费（Grubhofer）和施莱思（Schleith）首次制成固定化酶。19691973年，日本的千畑一郎首次在工业生产上连续生产L-氨基酸、L-天冬氨酸，开创了固定化酶和固定化微生物细胞应用于工业生产的先例；1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精。1978年，日本固定化枯草杆菌细胞生产-淀粉酶的研究取得成功。1986年，我国用固定化枯草杆菌原生质体生产碱性磷酸酶，用固定化黑曲霉原生质体生产葡萄糖氧化酶，用谷氨酸棒杆菌原生质体生产谷氨酸脱氢酶。2、优势 固定化细胞和固定化原
2、生质体以酶等各种代谢产物的生产为目的，可以代替游离细胞进行酶的发酵生产，具有提高产酶率、缩短发酵周期并可连续发酵生产等优点，在酶的发酵生产中有广阔的发展前景。 3、现状 在工业上使用的固定化酶还仅限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的十几个酶种，仍需大力研究开发使更多的固定化酶和细胞能适用于工业规模生产。 Section 2 酶的固定化 为了解决酶的稳定性较差、酶的一次性使用、酶的分离纯化等困难，获得的改善方法之一就是固定化技术的应用。固定化酶（Immobilized Enzyme）：固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。 酶的固定化：采用各种方法，将酶与水不
3、溶性载体结合，制备固定化酶的过程。（一）制备方法固定化酶的制备方法很多，常用的有吸附法、包埋法、结合法和交联法。根据酶自身的性质、应用目的、应用环境来选择固定化载体和方法。1）吸附法（adsorption）：利用各种固体吸附剂将酶吸附在其表面上固定的方法，是固定化中最简单的方法。可分为物理吸附法和离子吸附法。 物理吸附法（physical adsorption）：通过物理方法将酶直接吸附在水不溶性载体（纤维素、淀粉、面筋、活性炭、多孔玻璃、硅胶等）表面而使酶固定化的方法，是制备固定化酶最早采用的方法。 离子吸附法（ion adsorption）：通过离子键使酶与载体相结合的固定化方法。常用载体
4、有DEAE-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、CMC等。吸附容量一般大于物理吸附法。 吸附法制备固定化酶，操作简便，条件温和，载体廉价易得，且可反复使用。但结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落。2）包埋法（entrapment）：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。根据载体材料的不同，可分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。 凝胶包埋法：酶被包埋成网格型。常用的载体有天然凝胶、合成凝胶或树脂等。 微胶囊包埋法：酶被包埋成微胶囊。常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等。使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止酶与微囊外的环境直接接触，从而增加了酶的
5、稳定性。3） 结合法(binding）：将酶与聚合物载体以共价键或离子键结合的固定化方法，是固定化酶研究中最活跃的一大类方法。用结合法制备的固定化酶，酶和载体之间结合相当牢固，即使用高浓度底物溶液或盐溶液，也不会使酶分子从载体上脱落下来，具有酶稳定性好、可连续使用较长时间的优点。4） 交联法（cross-linking）：借助双功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。应用最广泛的双功能试剂是戊二醛。 以上四种固定化酶方法各有其优缺点。往往一种酶可以用不同方法固定化，但没有一种固定化方法可以普遍地适用于每一种酶。在实际应用时，常将两种或数种固定化方法并用，以取长补短。（二）固定化酶的
6、优缺点1、优点：1）无需进行酶的分离纯化，大大降低成本；2）提高了酶的稳定性和对污染的抵抗力；3）细胞生长停滞时间短，反应快。2、缺点：1）固定化酶的活力有所损失；2）必须保持菌体的完整，需防止菌体的自溶；3）载体、细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍。Section 3 细胞的固定化固定化细胞：固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。细胞的固定化：采用各种方法，将细胞与水不溶性载体结合，制备固定化细胞的过程。细胞固定化方法：吸附法、包埋法。（一）固定化微生物细胞的特点1、保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好，可按照原来的代谢途径进行新陈代谢，并进行有效的代谢调节控制。
7、2、发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长的一段时间。3、密度提高，可以提高产率。（二）固定化植物细胞的特点1、由于有载体的保护作用，可提高植物细胞的存活率和稳定性。2、细胞被束缚在一定的空间范围内进行生命活动，不容易聚集成团。3、可反复使用或连续使用较长的一段时间，大大缩短生产周期，提高产率。4、易于与培养液分离，利于产品的分离纯化，提高产品质量。（三）固定化动物细胞的特点1、由于有载体的保护作用，可提高动物细胞的存活率。2、动物细胞固定化后，可先在生长培养基中生长繁殖，使细胞在载体上形成最佳分布并达到一定的细胞密度后，转移至发酵培养基，控制发酵条件，使细胞从生长期转变到生产期，以利于提
8、高产率。3、可反复使用或连续使用较长的时间。4、易于与产物分开，利于产物分离纯化，提高产品质量。Section4 原生质体的固定化 固定化细胞只能用于生产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物；而且由于载体的影响、使营养物质和产物的扩散受到一定的限制；为解决这些问题，很多人从不同的角度进行研究。 微生物细胞和植物细胞除去细胞壁后，就可获得原生质体。原生质体很不稳定，容易破裂，若将原生质体用多孔凝胶包埋起来，制成固定化原生质体，由于有载体的保护作用，就会使原生质体的稳定性提高，免至破裂。同时，固定化原生质体由于去除了细胞壁这一扩散障碍，有利于氧的传递、营养成分的吸收和胞内产物的分泌。 固定化原生质
9、体的制备主要包括原生质体的制备和原生质体固定化两个阶段。一、原生质体的制备将对数生长期的细胞收集起来，悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中。然后加入适宜的细胞壁水解酶，在一定的条件下作用一段时间，使细胞壁破坏。分离除去细胞壁碎片、未作用的细胞以及细胞壁水解酶，而得到原生质体。要进行原生质体固定化，必须将微生物细胞和植物细胞的细胞壁破坏而分离出原生质体。同时要在破坏细胞壁的时候，不能影响到细胞膜的完整性，更不能使细胞内部的结构受到破坏，为此只能使用对细胞壁有专一性作用的酶。细菌原生质体制备时主要采用从蛋清中得到的溶菌酶；酵母细胞壁采用1,3-葡聚糖酶；霉菌的细胞壁需有几丁质酶与其他有关酶共同作用
10、；植物细胞壁应用纤维素酶和果胶酶。二、原生质体固定化 原生质体制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制成固定化原生质体。 原生质体固定化一般采用凝胶包埋法。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶和光交联树脂等。 固定化原生质体具有下列特点。 由于解除了细胞壁这一扩散屏障，可增加细胞膜的通透性，有利于氧气和营养物质的传递和吸收，也有利于胞内物质的分泌，可显著提高产率。 由于有载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可反复使用和连续使用较长的时间，利于连续化生产。在冰箱保存较长时间后仍能保持其生产能力。 易
11、于和发酵产物分开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量。 发酵的培养基中需要添加渗透压稳定剂，以保持原生质体的稳定性。这些渗透压稳定剂在发酵结束后，可用层析或膜分离技术等方法与产物分离。 Section 5 固定化酶反应器酶反应器：以酶作为催化剂进行反应所需的装置。根据酶催化剂类型的不同，分为游离酶反应器和固定化酶反应器。固定化酶反应器：搅拌罐型反应器、填充床式反应器、流化床式反应器、膜型反应器1搅拌罐型反应器分类：包括分批搅拌罐式反应器（BSTR）和连续流搅拌罐式反应器（CSTR）。连续流搅拌罐式反应器在运转过程中，底物以恒定的流速流入反应器，与此同时，反应液则以同样的流速流出反应器。反应桶内
12、装有搅拌器，使反应组分与固定化酶颗粒混合均一，出口处有过滤膜，可使不断补充新鲜底物与反应液流量维持动态平衡。优缺点：结构简单，温度和pH容易控制，造价较低，传质阻力很小，反应能迅速达到稳态，主要应用在饮料和食品工业中。其缺点是操作麻烦，在反复回收过程中固定化酶容易损失。2填充床式反应器 填充床式反应器(packed column reactor，PCR)是把颗粒状或片状固定化酶填充于填充床内，底物按一定方向以恒定速度通过反应床。它是一种单位体积催化剂负荷量多、效率高的反应器。当前工业上多数采用此类反应器。填充床式反应器可使用高浓度的催化剂，反应产生的产物和抑制剂可从反应器中不断地流出。3流化床
13、式反应器流化床式反应器(fluidized bed reactor，FBR)是一种装有较小颗粒的垂直塔式反应器(形状可为柱形、锥形等)。底物以一定速度由下向上流过，使固定化酶颗粒在浮动状态下进行反应。流体的混合程度可认为是介于CSTR和PFR之间。它具有下列优点：具有良好的传质及传热的性能，pH、温度控制及气体的供给比较容易；不易堵塞，可适用于处理黏度高的液体；能处理粉末状底物；即使应用细粒子的催化剂，压力降也不会很高。但其也有如下缺点：需保持一定的流速，运转成本高，难于放大；由于颗粒酶处于流动状态，因此易导致粒子的机械破损；由于流化床的空隙体积大，所以酶的浓度不高；由于底物的高速流动使酶冲出
14、，从而降低了转化率。使底物进行循环是避免催化剂冲出、使底物完全转化成产物的常用方法。也可以使用几个流化床组成的反应器组或使用锥形流化床反应器。4膜型反应器 由膜状或板状固定化酶或固定化微生物组装的反应器均称为膜型反应器(membrane reactor，MR)。固定化酶膜型反应器是以膜作为固定化酶的载体，酶通过吸附、交联、包埋、化学键合等方式被“束缚”在膜上，在进行酶促反应的同时，利用膜的选择性透过作用，在有外推力(压差、电位差等)的情况下，实现产品的分离、浓缩和酶的回收再利用。可以说酶膜反应器集催化反应、产物分级、分离与浓缩以及催化剂回收于一体。 第四节 固定化技术的应用（一）固定化酶的应用
15、固定化酶的优点： 酶的稳定性增加，减少温度、pH值、有机溶剂和其他外界因素对酶的活力的影响，可以较长期地保持较高的酶活力。 固定化酶可反复使用或连续使用较长时间，提高酶的利用价值，降低生产成本。 固定化酶易于和反应产物分开，有利于产物的分离纯化，从而提高产品质量。故此，固定化酶已广泛地应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等领域。1、固定化酶在工业生产中的应用：（1）氨基酰化酶：世界上第一种工业化生产的固定化酶。用结合法获得固定化氨基酰化酶后，可以将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，生产成本可节省40%。（2）葡萄糖异构酶：世界上生产规模最大的一种固定化酶。用结合法或交联法获
16、得固定化葡萄糖异构酶后，可以催化葡萄糖异构化生成果糖，用于连续生产果葡糖浆。（3）青霉素酰化酶：在医药工业上广泛应用。用结合法获得固定化青霉素酰化酶，可以催化青霉素水解生成6-氨基青霉烷酸（6-APA）。（4）天冬氨酸酶：采用包埋法制成固定化天冬氨酸酶，可将延胡索酸转化生产L-天冬氨酸。（5）延胡索酸酶：采用包埋法制成固定化延胡索酸酶，可从延胡索酸制造L-苹果酸。（6）乳糖酶：采用结合法制成固定化乳糖酶，可用于水解乳中存在的乳糖，生成半乳糖和葡萄糖，用于制造低乳糖奶。（7）天冬氨酸脱羧酶：采用包埋法制成固定化天冬氨酸脱羧酶，可催化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸。 2固定化酶在酶传感器方面的应用 研
17、究得最多、应用最广泛的是酶电极，如葡萄糖氧化酶电极：用聚丙烯酰胺凝胶包埋法将葡萄糖氧化酶固定化，制成厚度为2050 m的酶膜，再与氧电极及使氧容易通过的聚四氟乙烯等高分子薄膜密切结合，组成葡萄糖氧化酶电极。使用时，把酶电极进入样品溶液中，样品液中的葡萄糖扩散到酶膜中，酶催化葡萄糖与氧反应，生成葡萄糖酸，使氧被消耗，再由氧电极测定氧浓度的变化，即可知道样品中葡萄糖的浓度。 酶电极用于样品组分的分析检测，有快速、方便，灵敏、精确的特点。二、固定化微生物细胞的应用 固定化微生物细胞的应用范围很广，归纳起来主要用在两个方面：一是利用固定化微生物细胞发酵生产各种胞外产物；二是利用固定化微生物细胞与各种电
18、极结合制成微生物电极。1利用固定化微生物生产各种产物：其中主要有下面几类物质。(1)酒精酒类：固定化酵母等微生物可用于生产酒精、啤酒、葡萄酒、米酒等。(2)氨基酸：固定化氨基酸生产菌可用于生产谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、瓜氨酸等氨基酸。(3)有机酸：固定化黑曲霉等微生物可生产苹果酸、柠檬酸、葡萄糖酸、乳酸、醋酸等有机酸。(4)酶和辅酶：固定化微生物可用于生产-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、溶菌酶等胞外酶，及辅酶A、ATP等辅酶。(5)抗生素：固定化微生物可用于生产青霉素、四环素、头孢霉素、氨苄青霉素等抗生素。 (6)用于有机溶剂、维生素、化工产品等的生产，甾体转化、废水处理等。2固定化
19、微生物细胞制造微生物传感器微生物传感器：由固定化微生物细胞与各种能量转换器(电极、燃料电池、场效应管等)密切结合而成的传感装置，可分为呼吸活性测定型和电极活性测定型两种。微生物传感器应用范围：用于测定可发酵性糖、葡萄糖、甲酸、乙酸、甲醇、乙醇、头孢霉素、谷氨酸、氨、硝酸盐、生化需氧量(BOD)、细胞数量等。三、固定化动物细胞的应用 1、生产疫苗：小儿麻痹症疫苗、风疹疫苗、狂犬病疫苗、麻疹疫苗、肝炎疫苗、口蹄疫疫苗等；2、生产激素：生长激素、干扰素、胰岛素、前列腺素、催乳激素、白细胞介素、促性腺激素等；3、生产血纤维溶酶原激活剂、胶原酶等酶类；4、生产抗菌肽等多肽药物；5、生产皮肤、心脏等各种组
20、织器官。四、固定化植物细胞的应用 1、制造人工种子。将一定数量的植物细胞悬浮在含有适宜营养物质的一定浓度的海藻酸钠溶液中，用注射器或滴管滴入到一定浓度的钙离子溶液中，形成海藻酸钙凝胶，植物细胞包埋固定化在多孔凝胶中，制备得到人工种子。在一定条件下，每一个细胞都可以长成一棵完整的植株，因此可以获得大量具有相同遗传特性的植株，这对种子的保存具有重要意义，并可以节约种子的用量。2、生产各种色素、香精、药物、酶等次级代谢物。一般仅适用于可分泌到胞外的产物的生产。五、固定化原生质体的应用 固定化原生质体的优点：1）保持细胞原有的新陈代谢特性，可以照常产生原来在细胞内产生的各种代谢产物；2）去除细胞壁这一
21、扩散屏障，有利于胞内产物不断分泌到胞外，可以不经过细胞破碎和提取工艺而在发酵液中获得所需的发酵产物。固定化原生质体可用于各种氨基酸、酶和生物碱等物质的生产以及甾体转化等。1氨基酸的生产：以琼脂-多孔醋酸纤维素固定化黄色短杆菌原生质体，有利于谷氨酸的分泌，产率为固定化细胞的2.6倍，且可反复使用6批。2胞内酶的生产：固定化枯草杆菌原生质体生产碱性磷酸酶，产率提高36，可连续使用37 d。3生物碱的生产：固定化麦角菌原生质体生产麦角碱，可连续使用15 d。4甾体转化：固定化胡萝卜原生质体进行甾体转化的研究，可以催化毛地黄毒苷进行5-羟基化反应，生成杠柳毒苷。5木质素降解：固定化白腐真菌原生质体进行降解木质素的研究，降解能力比游离细胞显著提高。