双脱氧末端终止法测序全解.doc

《双脱氧末端终止法测序全解.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《双脱氧末端终止法测序全解.doc（9页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、快速序列测定：双脱氧末端终止法06级生科A班 苏狄064120202摘 要：核酸的序列分析，即核酸一级结构的测定，是现代分子生物学中 一项重要技术。目前应用的两种快速序列测定技术是San ger等（1977年）提出的双脱氧链终止法及 Maxam和Gilbert （ 1977年）提出的化学降解法，其中 双脱氧链终止法是目前应用最多，最好的技术。关键词：快速序列测定、双脱氧末端终止法目前应用的两种快速序列测定技术是 Sanger 等（1977）提出的酶法（双脱 氧链终止法）和Maxam（ 1977）提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这 两种方法都同样生成相互独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸

2、， 每组核苷酸都 有共同的起点，却随机终止于一种（或多种）特定的残基，形成一系列以某一特 定核苷酸为末端的长度各不相同的寡核苷酸混合物， 这些寡核苷酸的长度由这个 特定碱基在待测DNA片段上的位置所决定。然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳，经放射自显影后，从放射自显影胶片上直接读出待测 DNA1的核苷酸 顺序。高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳亦是 DNA序列测定技术的重要基础，可 分离仅差一个核苷酸、长度达300500个核苷酸的单链DNA分子。DNA序列测定 的简便方法为详细分析大量基因组的结构和功能奠定了基础， 时至今日， 绝大多 数蛋白质氨基酸序列都是根据基因或 cDNA的核苷酸序列

3、推导出来的。除传统的双脱氧链终止法和化学降解法外，自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。此外，新的测序方法亦在不断出现，如上世纪90年代提出的杂交测序法（sequencing by hybridization ，SBH 等。双脱氧末端终止法测序一、原理双脱氧末端终止法是 Sanger 等在加减法测序的基础上发展而来的。其原理 是：利用大肠杆菌DNAR合酶I,以单链DNA为模板，并以与模板事先结合的寡 聚核苷酸为引物，根据碱基配对原则将脱氧核苷三磷酸（dNTP底物的5-磷酸基团与引物的3 -OH末端生成3 ,5 -磷酸二酯键。通过这种磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA得以从5一3延伸

4、。Sanger引入了双脱氧核甘三磷 酸（ddTNP作为链终止剂。ddTNFt匕普通的dNTP在 3位置缺少一个羟基（2 ,3 -ddNTP）（图7-4-1 ），可以通过其5三磷酸基团掺入到正在增长的 DNA链中， 但由于缺少3 -OH,不能同后续的dNTP形成3 ,5 -磷酸二酯键。因此，正在 增长的DNA链不再延伸，使这条链的延伸终止于这个异常的核甘酸处。这样，在4组独立的酶反应体系中，在 4种dNTP混合底物中分别加入4种ddNTP中的一 种后，链的持续延伸将与随机发生却十分特异的链终止展开竞争，在掺入ddTNP的位置链延伸终止。结果产生 4组分别终止于模板链的每一个 A、每一个C、每 个

5、G和每一个T位置上的一系列长度的核甘酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳，从放射自显影胶片上直接读出 DNA上的核甘酸顺序。双脱氧链终止法 测序原理如图7-4-2所示。OOIIHOPOPOIIOHOHOHaOH HA, C,G or TdNTPOIIOII .H OPOPOOPOh代 C,G or TO1 ddNTP 2HHY3图7-4-1脱氧核甘三磷酸和双脱氧核甘三磷酸分子结构5 GAGTCACACTTGAC 3待测单链 DNA3 CTG 5引物、Klenow酶、dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP 和少量 a -32P-dATP加ddCTP反应加ddATP反应3ACTG 53

6、AACTG 53CAGTGTGAACTG 53CTCAGTGTGAACTG 53AGTGTGAACTG 5加ddTTP反应3TGAACTG 53TGTGAACTG 53TCAGTGTGAACTG加ddGTP反应3GAACTG 53GTGAACTG 53GTGTGAACTG 5AC变性凝胶电泳、T放射自显影r_ 测序图谱识读5G A GT C ACAC T T3图7-4-2双脱氧链终止法测序原理二、Sanger法DNA测序的试剂（一）模板有两种类型的DNA模板可以作为San ger法测序的模板，即纯化的单链 DNA 和经热变性或碱变性的双链 DNA1 单链DNA模板：在一般情况下，可将靶 DNA

7、片段克隆于M13m载体，从 重组克隆M13m系列噬菌体颗粒中分离得到的单链 DNA模板。这种单链模板效果 最佳，只要细心掌握模板与引物的最佳比例， 有经验的测序人员通过一次末端终 止反应，能读取500个以上的核苷酸序列。2 经热变性或碱变性的双链 DNA模板：尽管采用变性双链 DNA乍测序模板 显然简单且方便，但实际上很难获得单链模板那样的满意结果。利用双链质粒模 板测序，其中有两个至关重要的因素，即模板的质量和聚合酶的种类。用小量制 备的质粒DNA来测定未知序列的DNA克隆往往因为有污染而并不可取，高纯度的 质粒最好采用氯化铯 - 溴乙锭梯度平衡超速离心法制备。其次是应采用高质量的 聚合酶。

8、一次末端终止反应亦可能读出 300核苷酸序列。 应该注意的是， 适合做 双链模板的质粒， 最好具有较高的拷贝数并有插入失活的选择标志， 有配套的通 用引物结合区。最常用的载体系统是pUC系列、pGEM系列及Bluescript系列等。 双链模板测序最大的优势是对已知序列 DNA勺亚克隆进行鉴定，可省略再经M13 载体亚克隆获取单链模板过程。（二）引物 酶促测序反应中利用一个与模板链特定序列互补的合成寡核苷酸作为 DNA 合成的引物。在许多情况下，可将靶 DNA片段克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体， 以取得单链DNA分子作为模板。但也可以采用San ger法商定变性双链DNA莫板 的序列。在以上两

9、种情况下，都可以采用能与位于靶DNA则翼的载体序列相退火的通用引物，而不必取得与未知DNA序列互补的引物。适于M13噬菌体重组克 隆的通用测序引物一般长15-29个核苷酸，并可与紧靠 M13mp18筮菌体多克隆 位点区的Hind川位点成M13mp19噬菌体多克隆位点区的EcoRI位点的序列互补。 这些引物同样也可用于对克隆于 pUC质粒的DNA进行“双链”测序，并可从许多 厂商中购置得到。 此外，还有若干家公司出售一些引物， 这些引物下为了对通过 多种限制酶切位点克隆于不同质粒的靶 DNA进行测序而设计的。（三）DNA聚合酶如前所述，选用合适的DNA聚合酶进行测序反应也是保证测序质量的重要因

10、素之一。常用于双脱氧末端终止法测序的有几种不同的酶：其中包括大肠杆菌 DNA聚合酶I的Klenow片段（Sanger等，1977），反转录酶（见文献，女口 Mieredorf 和Prfeffer，1987）经过修饰消除了 3 5外卜节酶活性的T7噬菌体DNA聚合酶（Seque nasg和测序酶 2.0）， Tabor和 Richards on，1978惟及从嗜热水生菌（Thermus aquaticus分离的耐热DNA聚合物（Taq DNA聚合酶）。这些酶的特 性差别悬殊，因而可大大影响通过链终止反应所获得的 DNA 序列的数量的质量。（1）大肠杆菌 DNA 聚合酶 IKlenow 片段：这种

11、酶是最初用以建立 Sanger 法的酶，也是至今仍然广泛用于 DNA 序列测定的酶。 通常碰到的两个问题是： 1）Koenow 片段的持续合成能力低，以致一些片段并非由于dd NTP 的掺入，而是因为聚合酸人模板上随机解离而终止合成， 因而导致背景增高。 由于该酶不能沿模板进行长中距离移动， 因此利用该酶进行的标准测序反应所得序列的长度有 限。通常，这一反应只能得到大约 250-350 个核苷酸的序列。 如果分两步进行 反应，所得序列的数目可以翻一番； 其中第一步是初始标记步骤， 采用低浓度的 dNTP,而随后的第二步是链延伸链终止反应，含有ddNTP和高浓度的dNTP(Johoston-Do

12、w等，1987;Stambaugh和 Blakesley，1988)。然而即使有了这些改 进，用 Klenow 酶所测序列的长度通常还是不如持续合成能力较强的测序酶。2)这种酶对模板中的同聚核苷酸段或其他含牢固二级结构的区域进行复制的效能 很低。将聚合反应的温度提高到55C，可以缓解但并不能彻底解决这一问题(Gomer和Firtel ,1985)。有时可采用一些dNTP类似物如dITP或7脱氮dGTP ( 7 deaza-dGTP) 来获取模板中可形成稳定二级结构的相应区段的序列信息， 但 Kleow 酶对这些类似物的作用不如测序酶有效，这也许是因为它们使 Klenow 酶原已较低的持续合成能

13、力进一步降低。总而言这，可以选用大肠杆菌 DNA 聚 合酶 IKlenow 片段测定从引物 5位置起 250个碱基以内的一段 DNA 序列， 但不 宜用它来测定更长一段 DNA 序列或者具有二重对称和(或)同聚核苷酸段的 DNA 序列。( 2)反转录酶：尽管日常测序工作并不广泛使用反转录酶，但有时用这个 酶解决一些由于模板 DNA 中存在 A/T 或 G/C 同聚核苷酸区而引起的问题。 来自 禽类和 鼠类反转 录病毒 的 反转录酶在 这一看 来要比 Klenow 酶略 胜一筹( Karanthaansis，1982;Graham 等,1986 ) ,尽管它们也许还是比测序酶逊色(Cameron

14、-Mills， 1988;Revak等 1988)。(3) 测序酶：测序酶(SequenaseTM是一种经过化学修饰的 T7噬菌体 DNA聚合酶。这酶原来具有很强的3 -5外切核酸活性，经过修饰后，这一活性大部分均被消除。测序酶2.0版是测序酶的基因工程产品，它完全缺失了 3 -5 外切核酸酶活性， 极其稳定而经活性要比经化学修饰的测序酶高 2倍。测序酶持 续合成能力很强， 聚合速率很高， 对诸如 dITP 和 7脱氮 dGTP 等用于提高分 子辨率使测序凝胶某些区段上的压缩条带得以分开的核苷酸类似物具有广泛的 耐受性。它是测定长段 DNA 序列的首选酶。 测序酶可以沿模板移动很长的距离， 因

15、而一套反应常常就可以测定数百个核苷酸的 DNA 序列。实际上，测得序列的 长度更多是受聚丙烯酰胺凝胶的分辨能力而不是受该聚合酶的特性所制约。 为了 充分利用测序酶极高的持续合成能力， 可采用两步测序反应。 第一步首先采用低 浓度的 dNTP 的较低温度， 以便将合成反应限制在适度之下并确保放射性标记 dNTP 和较低温度，以便将合成反应限制在适度之下并确保放射性标记 dNTP 的 有效掺入，这步反应的产物是仅仅延伸了 20-30 碱基的引物。 再将第一步反应 等分于 4 组 1 套的标准反应系统中，每组反应中都含有高浓度的 d NTP 和一种 ddNTP。这样聚合反应就得以继续，直至造成链终止

16、的核革酸掺入正在增长的链 中。（4）Taq DNA聚合酶：适用于测定在37 C形成大段稳定十级结构的单链 DNA 模板序列。这是因为Taq DNA聚合酶在70-75 C活性最高，这一温度下即使 GC 丰富的模板也无法形成二级结构。 按照 1nnis 等（1988）介绍的方法使用 Taq DNA 聚合酶进行测序， 在放射自显影片上得到的测序梯连续数百个碱基条带始终清晰 如一，表明这种酶的持续合成能力甚佳。模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上。模板链的每一个 A、每一个G或每一个T的位置上。循环测序法利用了热循环仪的自动循环的高效能力。循环测序反应与普通PCF反应有所不同。只需一条引物，通

17、过单引物进行热循环，模板DN/以线性方式被扩增，而不是标准 PCR的指数方式扩增；反应底物除四种脱氧核苷三磷酸（dNTP夕卜，还加入了双脱氧核苷三磷酸（ddNTP，进行扩增时，链的延伸终止 于掺入ddNTP的位置，产生分别终止于不同核苷酸的一系列不同长度的扩增片 段。（四）放射性标记的 dNTP传统的DNA测序方法都采用a -32P-dNTP作为放射性标记物，但由于32P发 射的高能B射线，常会引起二个问题。首先是导致放射自显影图谱条带扩散、分 辨率低，限制了识读序列的数量和准确性。其次是32P衰变会导致DNA样品分解， 通常都应在测序反应后 24h 内进行电泳，否则无法获得好的结果。近年来a

18、 -35S-dNTP被广泛采用，是由于35S产生较弱的B射线，克服了 32P的 二大缺点。 放射自显影图谱具有较高的分辨率和较低的本底， 测序反应产物可在 -20 C保存一周，而分辨率并不下降。（五）dNTP类似物二重对称的DNA区段（特别是GC含量高者）可以形成链内二级过程中不能 充分变性。因此将引起不规则迁移，使邻近的DNA条带压缩在一起，以致难以读 出序列。这种压缩现象归因于DNA二级结构的存在，而且不可能通过改变测序反 应中出序列。这种压缩现象归因于DN级结构地存在，而且不可能通过改变测 序反应中所用DNA聚合酶的种类而得到减轻。但是凝胶中的压缩区段往往可以通 过采用诸如diTP（2-

19、脱氧次黄苷15三磷酸）或7 脱氮dGTP（7脱氮 2 脱氧鸟苷 5 三磷酸）等核苷酸类似物进行分辨。这些类似物与普通 碱基的配对能力较弱，而且是测序酶和Taq DNA聚合酶等DNA聚合酶的合适底物（Gough和 Murray, 1983;Mixusawa 等，1986;Innis 等，1988）。但对某些压缩 条带，7 脱氮dGTP无济于事；同样，dITP也无补于另一压缩条带（尤其是得 于GC丰富区的缩条带）的分辨。如果需要采用类似物，首先可试用dOTP如果压缩条带用d ITP或7脱氮dGTP都无法分辨， 则转而测定另一条链的 DNA 序列几乎总能如愿以偿。如上所述，两种形式的测序酶和Taq

20、DNA聚合酶对核苷酸类似物的耐受性优于大肠杆菌 DNA聚合酶IKIenow片段。此外，制造厂商声称 在测定含稳固二结构的模板序列时， 测序酶 2.0 版要优于原来的测序酶。 测序酶 2.0 版持续合成能力强于测序酶，其作用总是一气呵成，很少半途而废，因而消 除了“鬼”带。 而且，测序酶 2.0 版对诸如 dITP 类核苷酸类惟物的耐受性看来 也优于原来的测序酶。（六）关于DNA序列的识读DN/序列的识读是一个熟能生巧的过程。注意几点技巧：在显影前后一定 要注意标明模板名称、 日期和测序人等， 并标明各套反应位置； 识读时从显而 易见的特征序列开始，如连续的同聚核苷酸（如TTTTT AAAAA或

21、交替出现的嘌呤和嘧啶（如GTGTGTGT 一旦找到这种序列，便可较快地确定目的序列的位三、双脱氧链止终法测定战略由于DNA一般都由几千个单核苷组成。而目前测定 DNA序列的最好方法，一次也只能测约600个核苷酸，因此进行DNA顺序测定前，需要用不同限制酶消化等测DNA使其降成小片段，分别克隆到pUC1,18pUCI18,pUC19,M13mp18,M13mp19等载体中，分别测定各小片段的顺序，由于不同限制酶产生的片段之间有交错重叠顺序，根据片段间和末端重叠序列，用计算机软件如 Mac Vector TM5.0分析DNA Assemblylign TM排列出各片段的位置，进而排出 DNA勺全序

22、列四、双脱氧链终止法测定方法以M13噬菌体为载体的双氧链终止法的实施步骤为例：1. M13噬菌体复制型双链 DNA（ RFDN）的制备。为了将待测双链DNA进行克隆，必须制备M13mp1或M13 mp19复制型（闭 环双链）DNA从M9 养基 中，挑起单个克隆大肠杆菌，JM101到50ml2X YT 培养基 中，37C振荡过夜。稀释1ml培养物到50ml2X YT培养中，于37C振摇 6h,转移2ml培养物于微量离心管中，12000g，离心5min细菌沉淀保留用于 分离复制型 RFDN，A 上清用于分离噬菌体单链 DNA。细菌沉淀用于分离复制型DNA可以采用标准的碱解方法或采用天美公司的Wiz

23、ard Miniperps DNA 试剂盒制备。（方法同分离质粒 DNA方法）。2. 重组噬菌体制备采用多克隆位点上的限制性内加酶切割待测DNA并采用相同内切酶切割M13噬菌体RFDN（采用Biol 101gene clean U试剂盒分别纯化内切酶切割后 的DNA片段），然后将待测外源 DNA片段与M13复制型载体DNA连接过夜，连 接反应物转染JM101感受态细菌，将连接物10卩l与200卩l感受态细菌混匀， 放置冰上4050min,再放在42C水浴2min,然后加入1ml新鲜的静止相JM101 培养物混匀，然后分别以 300卩l于含有IPIG （200mg/mI）和X-gal200mg/

24、ml 的2 X YT培养基. 上，于37C培养8h即可出现蓝色和白色噬斑，白色或称无菌 噬斑，即为阳性重组噬菌体。3. 单链噬菌体DNA（模板DNA的制备上述平板的每个白色噬菌斑是由一种重组 M13DN分子转染细菌后产生的， 如果取一个白色噬菌斑进行培养便可得到一种单链形式的DNA为此，挑取一个白色噬菌斑转接到一个新鲜制备的 0D600=0.1的大肠杆菌JM101培养物中， 于37T振摇5h左右，12000g离心10min,上清转移到另一新微量离心管中用 于分离单链DNA按1ml上清液中加入含20嘛乙二醇PEG-6000勺2.5m NaCl 200 卩l沉淀噬菌体，再用饱和酚抽提除去噬菌体蛋白

25、，最后用1/10体积的3mNaAc 和乙醇沉淀单链DNA浓度调至0.10.5卩g/卩l，也可采用天美公司的 Wizard TM M13DN纯化试剂盒分离纯化 M13单链DNA4引物制备可以购买通用引物或实验室合成 15bp26bp长度的引物，通常以2卩g/ml 的浓度贮存于-20 C备用。5微量滴板 进行大批量的模板测序时，常在密闭的微量离心管中进行与引物的退火反 应，然后在微量滴板中进行链延伸 - 链终止反应。6变性聚丙烯酰胺凝胶测序凝胶装置的大小形状均不相同，其主要参数有：长度通常为4050cm宽度通常为20cm厚度通常为0.30.4mm横截面形状为楔形 或锥形， 即顶部薄， 底部厚， 或者是将底部凝胶缓冲液的浓度提高； 加样槽； 整块凝胶上的温度应均一。7电泳后将凝胶干燥，放射自显影。8.凝胶上读取DNA序列。此时读取的是目的DNA勺互补链35的序列。参考文献：1 王曼莹主编 .分子生物学 .北京：科学出版社， 20062 裴黎.现代 DNA 分析技术理论与方法 .北京：中国人民公安大学出版社， 20023 赵亚华.生物化学与分子生物学实验技术教程 .北京：高等教育出版社， 20054 杨岐生.分子生物学 .杭州：浙江大学出版社， 20055 梁国栋.最新分子生物学实验技术 .北京:科学出版社， 2001