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1、West er nbl ot 一抗和二抗的选择Westernblot 一抗和二抗的选择抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型,可将抗体分为 IgM, IgG, IgA, IgD , IgE 五类,它们的重链分别为mu, gamma, alpha, delta, epsilon 链.在上述每一类别中,按重链构造上的变异又可分为几个亚类,例如人的IgG可分为IgG1, IgG2 , IgG3, IgG4四个亚类.轻链分为两种类型,kappa链和lambda链,但每种抗体中只存在一种类型的轻 链.二抗：二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体,上面通常连有 酶或荧光素等标签.由于二抗所具
2、备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛,如 western blot 通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质,ELISA 以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质,尤其是相应的抗原或抗体,免疫组织化学检测组织中 的特异性抗原,免疫细胞化学通过免疫学方法检测细胞的抗原组成,流式细胞术通过检测激光所激发荧光来鉴定别离不同类型的细胞及免疫沉淀通过抗原与抗体的 特异性结合作用来别离相应抗原.二抗针对某一特定物种如小鼠的所有抗体均具有 特异性,因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记,大大节省了时间和费用； 此外,一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子,从而使信号大大增强,提升了实验灵敏 度.二
3、,如何选择二抗一一根据一抗种属及类型选择适宜的二抗广义上是指专门和进行特异性反响和结合的抗体,在免疫学反响中,经常需要针对试验选 择不同的二抗,*捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品.检测任何目的靶 蛋白都有不止一种抗体可供选择,同时在后继试验中也会有不同的检测方案,因此在选择 二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求,一般来说,选择适宜的二抗需 要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源,例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体, 二抗那么选抗小鼠的二抗山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可；如果一抗是从兔血清里制备 的兔源多克隆抗体,那么相应的二抗
4、需要选择抗兔的二抗.即根据一抗的物种来源选择相应 的抗该物种的二抗.*捷能为您提供最全的抗不同种属的原装进口二抗,包括抗小鼠、大 鼠、兔、山羊、绵羊、人、豚鼠、猪、马、牛、鸡、鸭等二抗.【一抗的类别亚型】二抗需与一抗的类别或亚类相匹配.这通常是针对单克隆抗体而言.多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白,因此相应的二抗就是抗IgG抗体.其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述,如果你的一抗是小鼠IgM ,那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM.如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类IgG1 , IgG2a, IgG2b, IgG3,那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合,或者你也可以选择
5、专门针对这一亚类的二抗,例 如,如果你的一抗是小鼠IgG1,那么你可以选择抗IgG1的二抗,此种抗体在双标记实验中尤其适合.在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下,可以选用抗相应物种IgG.*捷能为您提供通用的IgG H+L二抗,或者特异性只结合IgM的Anti IgM mu Antibody、IgA 的 Anti IgA alpha-Antibody 、IgE 的 Anti IgE epsilon Antibody 等.【二抗的种属 来源】 一般来说,不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系,来源于山羊的二抗与来源于驴 的二抗在一般的实验里没有太多的差异.然而在一些特殊的实验里,如双标实验里,如
6、果 其中一个一抗是山羊来源的,一个是小鼠来源的,那么相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的 二抗,这时候,二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的.有相应的驴来源的二抗,非常适合 做类似双标的免疫实验.【二抗的耦联标记】一般来讲,耦联到二抗上的探针主要有酶辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶 AP或其衍生物 APAAP, PAP,荧光基团FITC、Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、 Dylight等、生物素、金颗粒.选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验.对于 Western Blot和ELISA,最常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验细胞免疫化 学,组织免疫化学,流式细胞术
7、中通常使用荧光基团标记的二抗,免疫组化中也可以使 用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗.如果想要更大程度的放大检测信号,可以使用 Biotin/Avidin 检测系统.在一些荧光检测方案中,那么需要选择不同的荧光标记；而金颗粒 标记的二抗那么更多的应用于免疫电镜中.*捷能为您提供上述所有不同类型标记的二抗.【是否经过血清吸附过的二抗】为减少二抗与样本的非特异性结合,*捷还能为您提供不同血清吸附的原装进口二抗.如您的检测样本是人源的蛋白,一抗是小鼠源的单克隆抗体,二抗就需要选择抗小鼠源的二 抗,如果您对实验的特异性要求很高,那我们向您推荐经过人血清吸附过的抗小鼠源的二 抗,这种二抗由于经过人血清
8、吸附而排除了与人源组织如 IgG等可能发生非特异性反 应的IgG,因此将非特异性结合降低到最低.一,一抗的选择检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择,为缩小抗体的选择范围选中适宜的抗 体,需要考虑如下几种因素：分析试验应用的类型l样本蛋白的结构性质l样本的种属l抗体宿主的种类l抗体的标记和检测l1 .分析试验应用的类型一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型,如：可以应用于WB IHC ICC ELASA分析等,如果抗体说明书没有提及的应用类型,并不意味着该抗体不 适用于此种分析应用类型,而仅是说明尚未经过此种分析试验验证,如果抗体不适用某些 分析试验,那么会在抗体说明书上
9、标注出来不适于某分析试验.2 .样本蛋白的结构性质了解样本蛋白的结构性质有助于选择最适宜的抗体,至少两方面因素需要考虑待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来,其中的免疫原包 括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体如：细菌或细胞,抗体说明书一般都有免 疫原的描述,如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域,那么 必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体.如果打算用FACS流式检测活细胞的外表蛋白,那么需要选择含该外表蛋白的胞外域来免疫制备的抗体.l样本的提取或处理过程：某些抗体要求样本经过某些特殊处理,例如：许多抗体只识别复原和变性的、表位已暴露不 受
10、二级四级结构阻碍的蛋白样本,另一方面,某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白.中选 择免疫组化的抗体时,应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织,而另一些抗体那么适用 于无需抗原修复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织,这些都会在抗体说明书上应用部 分标示出来l3 .样本的物种应选择物种相同或有交叉反响的抗体,抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反响,因 其氨基酸序列同源性较高,如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反响种属表中,并 不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白,而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证 过,应通过序列比对的方法来预测交叉反响,可应用 Expasy和NCBI BLAST来进行不同物
11、 种蛋白同源性比对.4 .一抗宿主物种的选择一般说来,在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时,一抗宿主动物的物种选择较为重要, 对于免疫组化而言,尽可能选择与样本不同种系物种的一抗,从而防止二抗与样本内源性 免疫球蛋白产生交叉反响,例如：检测小鼠样本蛋白,那么不应选择小鼠或大鼠源的一抗, 最好选兔源的一抗,那么二抗那么可选择偶联了检测分子酶、荧光素、生物素等的抗兔 IgG.如果选择有偶联物的一抗那么不适用上述情况,除免疫组化外的其它对不含内源性免疫 球蛋白样本的检测方法,那么抗体宿主物种的影响不大,如对不含IgG的细胞裂解物样本的western blotting 检测,尽管如此,含有血清的组织裂解物和组织培养上清中含有免疫球蛋 白,复原变性样本中含 IgG,在western blot检测中那么结合出现IgG分子50 and 25 kDa的 重链和轻链条带.经过吸附处理的二抗：不同来源的免疫球蛋白含有相似的结构,抗一个物种的抗体可能与 其他物种发生交叉反响,一次有些二抗经过了动物或人类IgG吸附处理,以减少非特异性背景.例如,如果是小鼠的组织或细胞,那么选择经小鼠血清或IgG吸附处理过的二抗可以减少非特异性结合.但是此种抗体识别表位的数量被大大减少.