三代遗传标记资料讲解.docx

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1、三代遗传标记三代遗传标记分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后开展起来的一种较为理想的遗传标记形 式,它以蛋白质、核酸分子的突变为根底,检测生物遗传结构与其变异.分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异.每 一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点：不受组织类别、发育阶段等影响.植株 的任何组织在任何发育时期均可用于分析.不受环境影响.由于环境只影响基因表达(转录与译),而不改变基因结构即DNA的核甘酸序列.标记数量多,普及整个基因组.多态性高,自然存

2、在许多等位变异.有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型,提供完整的遗传信息. DNA分子标记技术简单、快速、易于自动化.提取的 DNA样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利.因 此,DNA分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和 难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景.1. 1第1代分子标记1.1. 1 RFLP标记技术.1980 年Botesin 提出的限制性片段长度多态性 (Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP)可以作为遗传标记,开创了直接应用 DNA多

3、态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术 .RFLP是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小,反映DNA分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA序列上的微小变化,甚至1个核 甘酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丧失或产生,导致酶切片段长度的变化.优点：RFLP标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构 建遗传连锁图.缺点：在进行 RFLP分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂 交技术,既不平安又不易自动化.另外,RFLP对DNA多态性检出的灵敏度不高,RFLP连锁图上还有很多大的空间区.1.1.2 RAPD 标记技术.为了克服R

4、FLP技术上的缺点,Williams等于1990年建立了随机扩增多态 DNA Randomamplified polymorphic DNA ,RAPD技术,由于其独特的检测 DNA 多态性的方式使得RAPD技术很快渗透于基因研究的各个领域.RAPD是建立于PCR根底之上的分子标记技术,根本原理是利用一个随机引物 810个碱基通过PCR反响非定点地扩增 DNA片段 然后用凝胶电泳别离扩增片段来进行DNA多态性研究.对任一特定引物而言,它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量

5、和大小发生改变,表现出多态性.优点：与RFLP相比,RAPD技术简单 检测速度快,DNA用量少,实验设备简单,不需 DNA探针,设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析,不依赖于种属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,而且不需要同位素,平安性好.缺点：当然,RAPD技术受许多因素影响,实验的稳定性和重复性差,首先是显性遗传,不 能识别杂合子位点,这使得遗传分析相对复杂,在基因定位、作连锁遗传图时,会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析 用一个引物就可扩增出许多片段,而

6、且不需要同位素,平安性好.当然,RAPD技术受许多因素影响,实验的稳定性和重复性差,首先是显性遗传,不能识别杂合子 位点,这使得遗传分析相对复杂,在基因定位、作连锁遗传图时,会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降；其次,RAPD对反响条件相当敏感,包括模板浓度、Mg2 +浓 度,所以实验的重复性差.1. 1. 3 AFLP标记技术扩增片段长度多态技术(AFLP),又名限制片段选择扩增技术(Selective restrictionfragment amplifi2cation ,SRFA), 于 1993 年由荷兰 KEYGENE 公司的 Zabean 和 Vos 等创造,并已申请

7、专利.AFLP是近年来迅速开展起来的一种分子标记技术,它将基因组DNA用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头(与酶切位点 互补)连接起来,并通过5端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA片段,从而形成指纹图谱的分子标记技术.AFLP指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传.优点：它兼具 RAPD与RFLP的优点,有较高的稳定性,用少量的选择性引物能在较短 时间内检测到大量位点,并且每对引物所检测到的多个位点都或多或少地随机分布在多条染色体上,各染色体上AFLP标记的数目与染色体长度呈正相关(r = 0. 501),而一对引物获得的标记涉及的染色体数与标记数呈正相关(r = 0. 826).因

8、此,通过少量效率高的引物组合可获得覆盖整个基因组的AFLP标记.目前,AFLP作为一种高效的指纹技术,已在遗传育种研究中发挥它的优势.缺点：不过也有研究认为,AFLP对基因组纯度和反响条件要求较高,另外用于遗传作图 时,少数的标记与图谱紧密度有出入.此外,在RAPD和RFLP技术根底上建立了SCARSequence characterize damplified regions ,序列特异性扩增区域 、CAPSCleaved ampli2fied polymorphic sequence ,酶切扩增多态序列和 DAFDNAam2plified fingerprints ,DNA扩增指纹等标记技

9、术.这些技术的出现,进一步丰富、完善了第1代分子标记技术,增加了人们对DNA多态性的研究手段.1.2第2代分子标记1. 2. 1 SSR标记技术.在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列,如重复单位长度在 1565个核甘酸的小卫星DNAMinisatellite DNA,重复单位长度在 26个核甘酸的 微卫星DNA Microsatellite DNA .小卫星和微卫星DNA 分布于整个基因组的不同位点.由于 重复单位的大小和序列不同以拷贝数不同,从而构成丰富的长度多态性.Moore等于1991年结合PCR技术创立了 SSR Simple sequence repeat , 简单重复序列标记

10、技术.SSR 也称微卫星DNA,是一类由几个多为15个碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列,其中最常见的是双核甘酸重复,即CA n和TG n,每个微卫星DNA的核心序列结构相同,重复单位数目1060个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同.不同遗传材料重复 次数不同,导致了 SSR长度的高度变异性,这一变异性正是 SSR标记产生白根底.SSR标记 的根本原理：根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物,通过PCR反响扩增微卫星片段.由于核心序列重复数目不同,因而扩增出不同长度的PCR产物,这是检测DNA多态性的一种有效方法.微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性,而且一般为共显性,因此是一类

11、很好的分子标记.目前已利用微卫星标记 构建了人类、小鼠、大鼠、水稻、小麦、玉米等物种的染色体遗传图谱.优点：这些 微卫星标记 已被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种 鉴定、农作物育种、进化研究等领域.此外 ,SSR标记不仅能够鉴定名合体和杂合体,而且结果更加可靠,方法简单,省时省力.2. 2. 2 ISSR标记技术.ISSR即内部简单重复序列,是一种新兴的分子标记技术.1994年Zietkiewicz 等对SSR技术进行了开展,建立了加锚微卫星寡核甘酸 (Anchored microsatellite oligo nucleotides) 技术.他们用加锚定的微卫星寡核甘酸作引

12、物,即在SSR的5端或3 端加上24个随机选择的核甘酸,这可引起特定位点退火,从而导致与锚定引物互补的间隔不太大 的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增.这类标记又被称为ISSR ( Inter2simplesequence repeat )、ASSR(Anchored simple sequence repeats) 或 AMP2PCR .在所用的两翼引物中,可以一个是ASSR引物,另一个是随机引物.如果一个是5端加锚的ASSR引物,另一个是随机引物,那么被称为RAMP技术19.用于ISSR2PCR扩增的引物通 常为1618个碱基序列,由14个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从

13、而保证了引物与基因组 DNA中SSR的5 或末端结合通过PCR反响扩增SSR之间的 DNA片段.优点：SSR在真核生物中的分布是非常普遍的,并且进化变异速度非常快,因而锚定引物的ISSR2PCR可以检测基因组许多位点的差异.与SSR2PCR相比,用于ISSR2PCR的引物不需要预先的 DNA测序,也正因如此,有些ISSR引物可能在特定基因组DNA中没有配对区域而无扩增产物,通常为显性标记,呈孟德尔式遗传,且具有很好的稳定性和多态性.1. 3第3代分子标记1. 3. 1 SNP标记技术.单核甘酸多态性(Single nucleotide polymorphism ,SNP) 被称为第3代DNA

14、分子 标记,是指同一位点的不同等位基因之间个别核甘酸的差异,这种差异包括单个碱基的缺失或插入,更常见的是单个核甘酸的替换,且常发生在喋吟碱基(A与G)和喀咤碱基(C与T)之间.SNP标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异,被认为是应用前景最好的遗传标记.目前,已有2 000多个标记定位于人类染色体上,在拟南芥上也已开展出236个SNP标记.在这些SNP标记中大约有 30 %包含限制性位点的多态性.优点：检测SNP的最正确方法是 DNA芯片技术,最新报道的微芯片电泳(Microchip electrophoresis),可以高速度地检测临床样品的SNP ,它比毛细管电泳和板电泳的速度可分别提升10

15、和50倍.SNP与第1代的RFLP及第2代的SSR标记的不同有2个方面： 其一 ,SNP不再以DNA片段的长度变化作为检测手段,而直接以序列变异作为标记；其 二,SNP标记分析完全摒弃了经典的凝胶电泳,代之以最新的DNA芯片技术.1. 3. 2 EST标记技术.表达序列标签(Expressed sequence Tag , EST)是美国国立卫生研究院 (NationalInstitutes of Health ,NIH) 的生物学家 Venter于1991年提出的.随着人类基因组方案 的开展,EST技术首先被广泛应用于寻找人类新基因,绘制人类基因组图谱,识别基因组序列编码区等研究领域,之后又被广泛应用于植物基因组研究.EST是指在来源于不同组织的cDNA文库中随机挑选克隆、测序 得到局部cDNA序列,一个EST对应于某一种 mRNA 的cDNA克隆的一段序列,长度一般为150500 bp ,只含有基因编码区域.优点：EST可代表生物体某种组织某一时间的一个表达基因,所以被称之为“表达序列标鉴；而EST的数目那么显示出其代表的基因表达的拷贝数,一个基因的表达次数越多,其相应的cDNA克隆越多 所以通过对cDNA克隆的测序分析可以了解基因的表达丰度.目前 构建cDNA文库一般都使用试剂盒,方法成熟,而且飞速开展的 DNA测序技术也使得进一 步降低大规模DNA序列测定本钱成为可能 .