《丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展.docx（7页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展梁化亮生物与食品工程学院,常熟 215500Progress on antimicrobial peptide摘要蛋白酶抑制剂PIs是一类能抑制蛋白酶水解酶的催化活性的蛋白或多 肽,广泛存在于生物体,在许多生命活动过程中发挥必不可少的作用.根据活性位点氨基酸种类不同可将蛋白酶抑制剂分为四大类型：丝氨酸蛋白酶抑制剂、琉 基蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂. 其中尤以丝氨酸 蛋白酶及其抑制剂在体一些重要生理活动中起关键性的调控作用.其能对蛋白酶活性进行精确调控,包括分子间蛋白降解,转录,细胞周期,细胞侵入,血液凝 固,细胞凋亡,纤维蛋白溶解作用,补体
2、激活中所起的作用.关键词丝氨酸蛋白酶抑制剂 分类临床应用防御1丝氨酸蛋白酶抑制剂免疫系统是由组织,细胞,效应分子构成,并逐渐进化形成用于阻挠病原微 生物的侵入攻击,限制它们扩散进入宿主环境.这其中起到主要作用的是宿主产 生的蛋白酶抑制剂,广泛存在于生物体的蛋白酶抑制剂在机体与相应的蛋白酶形 成一个动态的系统,在生物体系以及一系列的生理过程中起着调控作用1,是生物体免疫系统的重要组成局部.它不仅能使侵入体的蛋白酶失活并且能将其清 除,使附着在宿主外表的病原细菌无法附着生存.其中丝氨酸蛋白酶及其抑制剂 在体一些重要生理活动中起关键性的调控作用.丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease i
3、nhibitor )泛指具有抑制丝氨酸 蛋白酶水解活性的一类物质,广泛存在于动物、植物、微生物体中3.在动物体中,丝氨酸蛋白酶抑制剂是维持体环境稳定的重要因素,一旦平衡失调即导致多 种疾病,任何影响其活性的因素也会造成严重的病理性疾病.它们最根本的功能是预防不必要的蛋白水解,调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡.作为调控物,丝氨酸 蛋白酶抑制剂参与机体免疫反响,对生物体的血液凝固、补体形成、纤溶、蛋白 质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重建、激素形成、激素转运、细胞蛋白 水解、血压调节、月中瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成等许多重要的生化反 应和生理功能有重要的影响4.鉴于其重要的生理功能,丝氨酸蛋
4、白酶抑制剂一 直倍受研究者的关注,目前已别离得到多种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂,同时如何 将其更好地应用于食品、医药领域也成为近来研究热点.1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂分类目前,典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂基于其序列、拓扑结构及功能的相似性, 至少可分为18个家族,如表1 1所示.不同家族抑制剂的空间结构也不同. 通常这类抑制剂是B片层或混合了 a螺旋和B片层的蛋白质,也可能是a螺旋或富含二硫键的不规那么蛋白质.但它们都拥有规的反响活性位点环的构象,从而使 这些非相关的蛋白质具有相似的生物学功能6.因此典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂 最明确最广泛地代表了蛋白质的趋同进化.1.2 SerpinsSerpins是
5、一类分子量较大的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族,氨基酸残基数为350-500个,具有保守的空间结构.Serpins多为单一肽链蛋白,其肽链结构可 表示为N端P15P9P1P1,P9P15-C端,Pl是被靶酶中的底物识别位 点识别的氨基酸7.距C端3040个氨基酸部位含有 RCL(reactive central loop) , RCLU露于蛋白外表,是serpins与目的蛋白相互作用的部位.Serpins 最开始被认为起源于原核组织,但是到目前为止已经在许多细菌和太古代的生物 中发现8-10.但是这些原核生物的基因是否为原核serpins或侧生基因转移产物的祖先还尚不得而知.1.2.1 Serpin
6、s 的结构结构生物学对于我们理解serpins的结构和功能起着重要作用.至今为止超 过80种serpins结构具有不同构象,尽管serpins结构多变,但是无论是无抑 制活性的卵清蛋白(ovalbumin )或有活性的抗胰蛋白酶(antitrypsin )却有着 一些共同结构11-12 o典型的serpins如antitrypsin 和ovalbumin都拥有3个0 片层(命名为 A, B, C)和8 9个a螺旋(hA hI).Serpins还有一个反 应活性环(RCL,它是一个凸出的,延伸的,暴露的环,它与蛋白酶凹陷的反响 位点高度互补,是抑制剂与目的蛋白相互作用的部位.二者的结合方式与酶与
7、底物的作用方式相似.RCL的氨基酸顺序决定了抑制剂的选择性.改变 RCL的氨基 酸顺序,尤其是Pl位点的氨基酸,也就改变了该抑制剂的蛋白酶选择性.多数 Serpins的P1部位均为精氨酸,并且他们能抑制不同的丝氨酸蛋白酶.RCLB被 靶酶之外的蛋白酶切除.比拟不同Serpins的氨基酸顺序发现：虽然典型的丝氨 酸蛋白酶抑制剂的同一个家族成员中,氨基酸序列呈现出高度的多样性,但RCL的主链构象却很相似,即RCLM具相邻部位的几个氨基酸顺序在该家族中是保守 的.即使在不同家族中也一样,在同酶形成复合物后,RCL勺主链构象就更加相似了13-14.Serpins能以多种结构稳定存在15:(1)与靶酶作
8、用之前的结构.与卵清蛋白等其它晶体结构类似,含有五条A B 折叠链和一个RCL旋区；(2)RCL被剪切的serpin ,其较链区与RCL镶嵌于A折叠；(3)C折叠解离出l链,使得较链区及RCL在无键断裂的情况下可以完全插 入到A折叠片段中(如PAI 2、抗凝血酶等)：(4)抗凝血酶的局部较链区插入于左折叠.除此之外,最为重要的是与酶形成复合物时的Serpin结构.非功能性抑制子卵清蛋白和潜伏性抑制子PAI - 1的RCL构型表现出两种极端的状态,卵清 蛋白的S4链不插入A折叠,而PAI-1的RCLlr部镶嵌到A一折叠中.然而,这两种具有极端结构的Serpin均不能抑制蛋白酶.对抗凝血蛋白酶、肝
9、素共价因 子H、MENT鼠类抗胰蛋白酶等抑制剂与靶酶的复合物进行X-射线晶体结构分析,发现RCLM的前两个氨基酸会插入顶部 A-折叠中.这种局部插入的构象由 于能使得共价因子更方便地结合并插入serpins中,进行完全暴露的形态转化叫17,因子它对于serpins是否具有抑制活性起到了关键作用.1.2.2 Serpins 的作用机制在二十世纪七十年代术期,研究者们认为：serpins与其它蛋白酶抑制剂不 同,它与靶酶以共价酯键相结合. 然而,这是通过分析SDS- PAGEH勺变性复合 物而不考虑其天然条件下的复合物得出的结论.后来的研究认为：天然的 Serpin/Protease复合物是可逆的
10、,因此二者不可能是共价结合,它不同于锁钥 构型,而是与Kunitz , Kazal型等小分子类抑制剂相似,很可能是形成米氏复合 物四.目前认为Serpin与其靶酶的作用方式有两种19: “底物途径和“自杀途 径.大局部serpins是以“底物途径与靶酶进行相互作用.在“底物途径中, Serpins与靶酶形成共价复合物20.Serpins结构研究说明复合物形成期间,会 发生构型转化紧密型松散型21-24,即RCL环插入B 片层A中形成一个额 外的第四股B束,这种构象变化对于serpins对靶酶的抑制作用相当重要.酶E 与抑制剂I先以氢键形成米氏复合物EI,然后再转换成亚稳态结构EIt, 然后丝氨
11、酸蛋白酶抑制剂 P1部位氨基酸的梭基与靶酶丝氨酸蛋白酶的梭基之间 形成酯键,继而转换成脂酰基复合物EI*,最后通过第二个复合物EIt*生成 被剪切的抑制剂I*和仍有活性的酶Eo上述可表示为：E+I FTEIt r一El*EIt* * E+I*第二种为“自杀途径.Serpin通过自杀性底物的作用机制与酶发生不可 逆的反响.酶最初与抑制剂的剪切位点P1-P1两侧的残具相互作用,形成非共价的米氏复合物,然后剪切位点键攻击酶活性位点丝氨酸,导致酶 Ser195及P1 位点跋基之间形成共价酯键,并且P1位点被剪切25.在“自杀途径中,Serpin 的剪切比拟缓慢,因此在 Serpin发生剪切之前,Ser
12、pin/Protease 复合物已经 分解.该途径可表示为:E+I -Et* ET一无+I* 1H2蛋白酶抑制剂临床应用天然的蛋白酶抑制剂具备抗病毒的潜能,能限制外源细菌释放的蛋白酶水解 抑制特异性病毒生长并使自身细胞不受伤害.基于上述功能,蛋白酶抑制剂作为药物使用已经被研究开发了好多年,目前已被用于治疗人类免疫缺陷病HIV和高血压等疾病260血管紧素转化酶ACE抑制剂是一个用于药物治疗的蛋白 酶抑制剂27.ACE能催化血管紧缩素I和血管紧缩素H的水解,一个有效的血管 收缩药能使缓激肽失活.而ACEffl制剂通过降低周围血管阻力到达降低血压的目 的,同时ACEffl制剂能降低蛋白尿和稳定肾功能
13、,对治疗糖尿病肾病有疗效.ACE 抑制剂的使用最初源于1977年.目前其它的ACEM制剂也已投入市场.这些药物制剂的研究成功引起了人们对于蛋白酶抑制剂治疗作用的极大兴 趣.下面将集中介绍蛋白酶抑制剂针对多种疾病的潜在使用价值.3鱼类的病原微生物及防御鱼类体外细菌,真菌和酵母菌生长所需的小分子化合物, 如游离的氨基酸或 者简单的糖类都来自于酶解体外的生物大分子,包括蛋白酶和糖甘酶.这在细菌蛋白酶不受宿主蛋白酶抑制剂调控时,对于细菌感染非常重要,它能破坏宿主蛋 白.目前的研究说明,许多病微原生物蛋白酶类都参与到了侵入组织进行破坏、 宿主防御系统的侵入和宿主免疫系统的调节等反响中.为了应对病原性细菌
14、的攻击,鱼类以多因子协调的方式一起作用.鱼类自身 有许多非特异性,特异性,体液和细胞免疫机制来反抗细菌性病害.非特异性的体液免疫因子包括蛋白酶抑制剂,如转铁蛋白和抗蛋白酶；溶菌酶,C活性蛋白CRP,抗菌肽和一些松散的,具有促炎症反响,趋化性和调理活性的补体参 与吞噬反响.这些反响都首先由中性白细胞和巨噬细胞进行. 吞噬细胞含有许多 水解酶,被细菌刺激后会产生活性氧类ROS.RO为高度杀菌的.另外,中性 白细胞具有大量的髓过氧化酶MPO,它能从卤化物离子和H2O2生杀菌离子. 巨噬细胞能接收来自中性白细胞的 MPO这能增强它们的抗菌活性.抗体组成了 特殊体液免疫系统,它能抑制细菌粘附或非吞噬细胞
15、的侵入, 并能使细菌毒性失 活.抗体可以作为调理素来激活补体,溶解细菌细胞,激活炎症反响,并进一步增强吞噬作用.巨噬细胞的杀菌活性可以被与特异性抗原接触的T淋巴细胞释放的细胞活素类激活.这其中最为重要的免疫因子就是蛋白酶抑制剂,它是一种针对病原性细菌分 泌的蛋白酶,改善由其参与的病理学过程,降低侵入细菌的生长速率,同时能重 新构建宿主防御的反响体系的物质.4研究意义与展望鲫鱼鱼卵作为一种丰富的水产资源, 具综合利用潜力有待进一步开发,以提 高其附加值.研究说明,鱼卵中存在多种蛋白酶抑制剂成分, 在鱼卵中除执行生 理调节功能外,在病原生物防御中也起到了重要作用. 然而,截止目前为止只对 少数鱼卵
16、中的蛋白酶抑制剂进行了研究,且大多集中于半胱氨酸蛋白酶抑制剂的 研究.因此,对其进行研究显得极为必要,既可以进一步揭示鱼类的自身防御机 制,探讨其在鱼卵中生理、防御功能,又可为其在食品医药等领域的应用提供基 础数据.1 Braun, N.J., Schnebli, H.P., . A brief review of the biochemistry and pharmacology of Eglin c, an elastase inhibitor. Eur. J. Respir. Dis. Suppl J. 1998, 146, 541 -547.2 Hibbetts, K., Hines,
17、 B., and Williams, D. An overview of proteinase inhibitors J. J. Vet. Intern. Med J. 1999, 13: 302-308.3文方德,傅家瑞.植物种子的蛋白酶抑制剂及其生理功能J.植物生理学通讯,1997, 33(1) : 134 Laskowski, M., and Kato, I. Protein inhibitors of proteinases J. Annu. Rev. Biochem. 1980, 49: 593-626.5 Laskowski, M., Qasim, M.A.,. What can
18、the structures of enzyme -inhibitor complexes tell us about the structures of enzyme substrate complexes? Biochim. Biophys. Acta J. 2000, 1477, 324 W37.6 Krowarsch, D., Cierpicki, T., Jelen, F., and Otlewski, J., Canonical protein inhibitors of serine proteases J. Cell Mol. Life Sci. 2003, 60: 2427-
19、2444.7 A . Bhattacharyya,C . R. BabuExploring the protease mediated conformmional stabilityin a trypsin inhibitor from Archidendron eilipticum seeds J Plant Physiology and Biochemistry J.2006, (44) : 637-6448 Irving JA, Pike RN, Lesk AM, Whisstock. Phylogeny of the Serpin Superfamily: Implications o
20、f Patterns of Amino Acid Conservation for Structure and Function. Genome Res J. 2000, 10 (12): 1845 -64.9 Irving J, Steenbakkers P, Lesk A, Op den Camp H, Pike R, Whisstock J. Serpins in prokaryotes. Mol Biol Evol J. 2002, 19 (11): 1881 -90.10 Cabrita LD, Irving JA, Pearce MC, Whisstock JC, Bottomle
21、y SP. Aeropin from the extremophile Pyrobaculum aerophilum bypasses the serpin misfolding trap. J Biol Chem J . 2007, 282 (37): 26802 911 Loebermann H, Tokuoka R, Deisenhofer J, Huber R. Human alpha 1-proteinase inhibitor. Crystal structure analysis of two crystal modifications, molecular model and
22、preliminary analysis of the implications for function. J Mol Biol J. 1984, 177 (3): 531 -57.12 Stein PE, Leslie AG, Finch JT, Turnell WG, McLaughlin PJ, Carrell RW. Crystal structure of ovalbumin as a model for the reactive centre of serpins. Nature J. 1990, 347 (6288): 99 102.13 Jones, S., and Thor
23、nton, J.M., Priciples of protein-protein interactions D. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 1996, 93: 13-20.14 Apostoluk, W., and Otlewski, J., Variability of the canonical loop conformations in serine proteinases inhibitors and other proteins. Proteins J. 1998, 32: 459-474.15 Paul C. R Hopkins.Smart R. Ston
24、e. The contribution of the conserved hinge region residuesofal-Antitrypsin to its reaction with elastase J . Biochemistry , 1995, 34： 872-879.16 Jin L, Abrahams JP, Skinner R, Petitou M, Pike RN, Carrell RW. The anticoagulant activation of antithrombin by heparin. Proc Natl Acad Sci U S A J .1997, 9
25、4 (26): 14683 -8.17 Whisstock JC, Pike RN, Jin L, Skinner R, Pei XY, Carrell RW, Lesk AM. Conformational changes in serpins: II. The mechanism of activation of antithrombin by heparin. J Mol Biol J. 2000, 301 (5): 1287 W05.18 Malgorzata Wilezynska,Ming Fa , Per-lngvar Ohlsson , et a1. The inhibition
26、 mechanism of serpins J. 1 995, 270(50) : 29652-29655.19超,冀新,止行,等.蛋向酶抑制剂麻川研究进展J.粮食与油脂,2005, (11):3720 Egelund R, Rodenburg K, Andreasen P, Rasmussen M, Guldberg R, Petersen T. An ester bond linking a fragment of a serine proteinase to its serpin inhibitor. Biochemistry J. 1998, 37 (18): 6375 -9.21 L
27、oebermann H, Tokuoka R, Deisenhofer J, Huber R. Human alpha 1-proteinase inhibitor. Crystal structure analysis of two crystal modifications, molecular model and preliminary analysis of the implications for function. J Mol Biol J. 1984, 177 (3): 531 -57.22 Whisstock J, Bottomley S. Molecular gymnasti
28、cs: serpin structure, folding and misfolding. Curr Opin Struct Biol J.2006, 16 (6): 761 -8.23 Gettins P. Serpin structure, mechanism, and function. Chem Rev J. 2002, 102(12): 4751 604.24 Whisstock JC, Skinner R, Carrell RW, Lesk AM. Conformational changes in serpins: I. The native and cleaved confor
29、mations of alpha(1)-antitrypsin. J Mol Biol. 2000, 296 (2): 685 -99.25 Gettins P.G .W., Keeping the serpin machine running smoothly. Genome Research 2000, 10: 1833-183527 Schwarcz, S. K., Hsu, L. C., Vittinghoff, E., & Katz, M. H. Impact of protease inhibitors and other antiretroviral treatments on acquired immunodeficiency syndrome survival in San Francisco, California, 1987-1996. Am J Epidemiol .2000, 152, 178-185.