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1、琼脂糖凝胶电泳鉴定 DNA【实验目的】 通过实验掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定 DNA 的原理与方法。 【实 验原理】 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种杂聚多糖，是由 D 型和 L 型半乳糖以a-1 , 3和伊1 , 4糖苷键相连形成的线状高聚物 （如下图所示） 。琼脂糖遇冷水膨胀，溶于热水成溶胶，冷 却后成为孔径范围从 50nm 到大于 200nm 的凝胶。 琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化 DNA 片段最为常用的 方法之一，这种方法简便易行。而且琼脂糖可以灌制成各种 形状、大小和孔径， 在不同的装置中进行电泳， 如果有必要， 还能够从凝胶中回收 DNA 谱带。 琼脂糖凝胶的分离范围较广，选择不同凝胶
2、浓度和装置，从 50 个碱基对到几兆不同长度的 DNA 都可以实现分离。使用 电场强度和电泳方向恒定的水平板琼脂糖凝胶电泳的方法， 可以很好的分离长度在 50-20,000 bp 的 DNA 片段。 DNA 在琼脂糖凝胶中的迁移率受多种因素影响。例如 DNA 分子 的大小；琼脂糖的浓度；所加电压等等。 DNA 片段越长，泳 动速度越慢，而且泳动速度与电场强度成正比。一个给定大 小的线性 DNA 片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移率不 同， DNA 电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。用低浓度的荧光染料如溴化乙啶染色后，凝胶中的 DNA 可 以直接被检测出来。紫外灯下可以直接检测到 20pg
3、的双链 DNA。【实验材料】1. 实验器材水平板电泳槽；灌胶模具及梳齿；电泳仪；55 C水浴；沸水浴；微量移液器2. 实验试剂（1）DNA 样品； DNA 标准分子量标记物；琼脂糖； 1x 电 泳缓冲液 TBE ； 6x 样品缓冲液（2）溴化乙锭：水中加入溴化乙啶，搅拌数小时至溶解。 将配好的 10 mg/ml 溴化乙啶溶液装在棕色瓶中， 室温保存， 使用时稀释至0.5卩g/ml。缓冲溶液配制表缓冲溶液工作溶液储存溶液（每升）TBE0.5x5x0.045mol/L Tris- 硼酸54 g Tris 碱 0.001mol/L EDTA27.5g 硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA (p
4、H8.0)6x 样品缓冲液0.2% 溴酚蓝储存温度4C 50% (w/v)蔗糖水液【实验操作】1. 照厂家说明准备好灌胶模具， 置于水平面上 (实验操作示 意图如下)。2. 配制 1%琼脂糖凝胶。 取 250ml 三角瓶，加入 100ml TBE 缓冲液，称取 1 克琼脂糖加入缓冲液中，沸水浴加热至完全 溶解，然后在55 C水浴中保温。在灌胶模具中插入梳齿， 将 稍微冷却的凝胶倒入灌胶模具。凝胶厚度 35mm ，避免气 泡产生。3. 室温放置 3045 分钟，待凝胶完全凝固后，按照厂家说 明将凝胶放入水平板电泳槽。 4. 在电泳槽中加入电泳缓冲液， 电泳缓冲液没过胶面 1mm ，拔下梳齿形成样
5、品池。5. 取样品与 6X 样品缓冲液按照比例混合后，用微量移液器 缓慢加入样品池中。6. 盖上电泳槽并且通电， 注意电源正负极， 确保样品向阳极 移动。恒压 15V/cm （按照两极之间距离计算） ，至示踪染 料溴酚蓝前沿距离凝胶前端 1cm 时，切断电源。7. 从电泳槽中取出凝胶，将凝胶置于 0.5ug/ml 溴化乙啶水 溶液中，室温下振摇染色 3045 分钟。8. 回收染色液，自来水冲洗凝胶后，于紫外灯下观察。 【注 意事项】1. 溴化乙啶是一种强诱变剂， 并有中度毒性， 取用含有这一 染料的溶液时务必戴手套。2. 紫外线对人体， 尤其是眼睛有危害性。 为减少紫外线照射， 必须确保紫外线光源受到遮蔽。