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1、苏州新加艮公司文件编号新波生物（生物技术有用生产工艺规程Q/SB-ZD (7)-PD-TWP001版本A/0NSE定量检测试剂盒分发编号页数6主管部i编制T： 生产 部人：批准日期审核批准人：人：发布日期实施日期神经元特异性烯醇化酶（NSE ）定量检测试剂盒（时间分辨免疫荧光法）生产工艺规程、总述1. 名称：中文：神经元特异性烯醇化酶（NSE）定量检测试剂盒英文： Time-resolved immunofluorometric assay kit for NSE2. 作用和用途：定量检测血清中NSE 含量，用于SCLC 的鉴别诊断等。3. 分离方法：包被抗体的固相分离法。4. 试剂盒的组成：
2、1包被有抗人NSE单抗的96孔板，一块（12孔X8）2 .筠（Eu3+）标记的抗NSE单抗（箱标记），一瓶，1.0 ml3校准品（A、 B、 C、 D、 E、 F ），一套，0.5ml/ 瓶，冻干品4浓缩洗液，一瓶,40ml5荧光增强液，一瓶,20ml6分析缓冲液，一瓶,20ml3 吸头： 20 支8 说明书，一份5. 试剂盒的技术指标5.1 物理性能液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；冻干组分应呈结晶或粉末状；所有组分应无包装 破损。5.2 准确性试剂盒校准品与相应浓度的企业标准品同时进行分析测定，用 Log B-log 拟合， 要求两条剂量-反应曲线不显著偏离平行；以NSE 企业标准品为对照品
3、，试剂盒校准品的实测效价与标定效价的比应在 0.9001.10范围内。5.3 剂量-反应曲线的线性用 Log B-log 或其他数学模型拟合，在校准品B 与校准品F 之间的浓度范围内，剂量-反应曲线相关系数（r）的绝对值应不低于0.9900。5.4 精密度分析内精密度（CV%）应不高于15.0%;分析间精密度（CV%）应不高于20.0%。5.5 分析灵敏度试剂盒分析灵敏度为最低检测限不大于0.7ng/mL 。5.6 质控血清测定值应在允许范围内。5.7 特异性与 AFP、 CEA、 CA125 交叉反应小于0.7ng/mL 。5.8 稳定性37 C放置7天,测定结果应符合上述 5.15.7项要
4、求。6. 正常值、病理值以本试剂盒对504 例正常人血清进行测定，NSE 临界值为14.00ng/ml 。7. 原材料及规格：名称规格厂家1 抗 NSE Ab中检维康2 NSE 抗原纯品Hytest396 孔板(钴辐射活化板国产4 )Tris(三羟甲基氨基甲烷)进口 /国产5 盐酸G.R上海化学试剂公司6 鸡冠花红A.R上海试剂三厂7 叠氮钠G.R上海生工生物工程有限公司8) 牛r球蛋白SIGMA9 双馏水自制10 Tween20上海生工生物工程有限公司11 BSA进口 /上海赛达生物药业有限公司12 无 水碳酸钠A.R上海虹光化工厂13 DTTA-Eu国产14 碳 酸氢钠A.R上海虹光化工厂
5、15 氯 化钠G.R上海化学试剂公司16 醋 酸钠A.R上海化学试剂公司17 醋 酸A.R上海化学试剂公司18 乙 二胺四乙酸二钠(EDTA)A.R上海化学试剂公司19 荧 光增强液自制20 浓 缩洗液自制NSE McAb 的制备工作液制备：移取一定量抗NSE McAb 于所需体积的碳酸钠缓冲液中(0.05 mol/L,pH9.5),使其浓度约为5闻/ml。封闭缓冲液的配制： 在 50mmol/L Tris-HCl 缓冲液 (pH7.8) 中加入一定量的BSA， NaN 3，使 BSA， NaN 3的浓度分别为1%， 0.05% 。将抗NSE McAb工作液按每孔100川加入微孔，室温静置24
6、小时(注意要防止水分蒸 发)。以洗板机吸干-洗涤二次。将封闭缓冲液按每孔150川加入微孔，室温封闭12小时(注 意要防止水分蒸发),然后倒掉封闭液，洗衣机甩干，抽干，热封。三、抗 NSE McAb 的标记和分离标记：将抗NSE抗体于48c用0.1 mol/L碳酸盐缓冲液(含0.9% NaCl , pH 9.6)透析36 小时。取出抗NSE 抗体，在电磁搅拌下按抗体/DTTA-Eu=5/1 的比例加入DTTA-Eu ，成分混匀后静置36 小时。分离 ： Ab-Eu 与游离 DTTA-Eu 通过 Sephadex G50 (8cm)+Sepharose 6B (38cm) 色谱柱(1.5 X50c
7、m)分离。洗脱液为 TSA : 0.05M Tris-HCl , pH 7.8 , 0.05%NaN 3, 0.9%NaCl。分离过程以核酸蛋白仪监控。四、 NSE 血清校准品和质控品的配制校准品稀释液的配制：NaAc 1.60g ， HAc 0.480mL ， NaCl 0.9g ， BSA 3.0g ， NaN 3 0.05g ，纯水 100mL ， pH 值为 5.0。校准品配制：用缓冲液将NSE浓缩液稀释成A、B、C、D、E、F六个点(浓度分别约0、1、5、20、100、500ng/mL ),以NSE企业标准品校正。分装，冷冻干燥后于 28c保存。质控品的配制：在人血清中加入不同量的N
8、SE溶液，使质控品各点的浓度分别为7、 20、80ng/mL,以企业标准品校正。分装，冷冻干燥后于 20 c贮存。五、实验所须缓冲液的配制NSE 分析缓冲液： 50mmol/l Tris-HCl ， pH 7.8 ， 含 2% BSA， 0.9% NaCl ， 0.1%Tween20 ，40umol/LEDTA,0.05% NaN3， 0.05% 牛 IgG,0.15% 小鼠血清，0.005% 鸡冠花红。2-8 贮存。六、血清NSE-DELFIA 的分析步骤1 试剂准备（ 1 ） 洗涤液：将40ml 浓缩洗液和960ml 蒸馏水在干净的洗液瓶中混合，作为工作洗涤液。（ 2） 校准品：在校准品中
9、加入0.5ml 去离子水，复融约10 分钟，混匀备用。（ 3 ） 铕标记物：使用前一小时内，按照需要用量以分析缓冲液稀释铕标记（1:20 ）。（4）将分析缓冲液、校准品、待测样品和所需数量的微孔反应条平衡至室温（2025 C） o2 .吸取25川校准品和待测样品，加入反应板微孔内。3 .在各微孔内加入100川已稀释的钻标记溶液，在室温（2025C）下于慢档振板60分钟。4 . 洗板 6 次。将板条在洁净的吸水纸上拍干。5 .在每个微孔内加入100 d增强液，于慢档振板5分钟。6 . 确定微孔反应板已固定在时间分辨荧光测定仪上，开始检测。七、试剂盒的贮存与运输试剂盒组装后贮存于2-8 C。严格禁
10、止在高温下运输试剂盒。八、注意事项1. 吸取增强液或铕标记物时，请使用本试剂盒提供的吸头，并避免尘土污染吸头。2. 使用前，分析缓冲液、校准品、待检样本和微孔反应板须恢复到室温。3. 铕标记物稀释后请在一小时内使用。4. 洗板机在洗涤时，须确认每孔中的洗涤液都注满微孔，洗涤后微孔内残留液体少，洗涤后 将微孔板倒扣在无尘吸水纸上拍干。5. 使用干净的一次性容器配制铕标记物，应避免铕标记物稀释液进入铕标记物原液中。6. 尽量建立一个干净无尘的实验室环境。不要混用不同批号的试剂，不要使用过期试剂。7. 加增强液和铕标记物时，吸头应悬空，避免因吸头碰到小孔边缘或其中试剂而造成增强液 和铕标记物的污染。8. 所有的样品和试剂盒应作为潜在的污染源看待，请按传染病实验室检查规程操作。9. 为保证实验的准确性，处理后得到的血样应不含纤维蛋白、红细胞、血脂等，并要保证血 样吸取的量的准确性，否则容易引起测量值的差异。10. 如对实验结果有疑问，应重复实验。九、试剂生产对环境的要求环境中各种相关仪器设备位置合理，地面、台面及各种物品整洁、有序；空气洁净度不低于11. 万级。十、关键工艺与关键原材料需注意铕标记的制备和校准品的配制。