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1、两个主要目的：(1)从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；(2)统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。,水生耐热细菌Taq ( Thermus aquaticus )耐高温的Taq DNA聚合酶美国微生物学科布鲁克（T.Brock)1966年发现耐热细菌,研究思路,（一）筛选菌株,尿素分子的立体结构,CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3,脲 酶,分解尿素的细菌:,在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,选择培养基,培养基配方,背景知识,测定微生物数量的方法：,1直接计数法：最常用显微镜直接计数法。,测定微生物数量的方法：,背景知识,1直接计数
2、法：最常用显微镜直接计数法。先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。,测定微生物数量的方法：,背景知识,优点：设备简单、能观察微生物的形态特征。,优点：设备简单、能观察微生物的形态特征。缺点：难以计数微小量多的细菌。 一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。,2间接计数法：最常用稀释平板计数法。,（二）统计菌落数目,（二）统计菌落数目,统计菌落数目的理论依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常
3、将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30300的平板进行计数。,每克样品中的菌株数 = (CV)M,C：某一稀释度下平板上生长的平均 菌落数V：涂布平板时所用的稀释液的体积 (ml)M：稀释倍数,统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。,注意：,两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1.第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2.第二位同学在该深度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为21、2
4、12和256，该同学以这三个平板菌落数的平均值163作为统计结果。,实例1,你认为哪位同学的结果更接近真实值？这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？,?,你认为哪位同学的结果更接近真实值？这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？,第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。,?,因此，这两位同学的实验需要改进，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与
5、准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,说明设置重复组的重要性。,在做本课题的实验时，A同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落。但是，其它同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。其他同学认为A同学的结果有问题。他们分析可能是A同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。,实例2,但是，A同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，A同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿不出令同学们信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？,一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。 一种方案：可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,另一种方案： 将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,实验设计,土壤中分解尿素的细菌的分离与记数,