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1、缺氧调控报告载体的构建与鉴定(1)作者： 杨洁， 李占亭， 杜德伟， 柴青焕， 王丽， 张惠中， 孙脊峰【关键词】荧光素酶Constructionandidentificationofhypoxiaregulatoryrep ortervectors【Abstract】AIM:Toconstructthefireflyluciferasereportergenevect orsregulatedbyhypoxiaresponsepromoters.METHODS:Theo ligonucleotidesofhypoxiaresponseelementandamutation controlwe
2、resynthesizedandclonedintopCIneovectorstoc onstrctHRE/CMVrecombinantvectors.ThenHRE/CMVpromote rsamplifiedbyPCRweresubclonedintopGL3Basicvectors.R ESULTS:Theintegrityreportervectorswereverifiedbyres trictionenzymedigestion.Also,thesequencesofthevecto rsweredetectedandalignedtotheexpectedsequences.CO
3、NC LUSION:LuciferasereportervectorsregulatedbyHRE/CMVp romotersweresuccessfullyconstructed,whichmakesitpos sibletofurtherinvestigatetheirpotencyofhypoxiaregulation.Keywords 】 transcriptionregulationhypoxia;responseelements ； luciferase ； reportergene【摘要】目的：构建能用来检测缺氧应答启动子转录调控作用的萤火虫荧光素酶报告载体. 方法：合成缺氧应答
4、元件的寡核昔酸序列及其突变对照，克隆入 pCIneo,构建 HRE/CM速组载体.然后采用PCRT法将HRE/CM的动子定向 亚克隆入pGL3Basic. 结果： 酶切和测序鉴定分析，所克隆的基因产物酶切结果与预期值一致，序列无碱基的突变. 结论：成功构建了缺氧应答启动子的荧光素酶报告载体，为进一步 研究其缺氧调控作用提供了条件.【关键词】转录；调控；缺氧; 反应元件；荧光素酶；报告基因0 引言目前已开发出多种报告载体用于研究启动子和/ 或增强子的调控活性：1-3 L如氯霉素乙酰转移酶报告载体，B半乳糖昔酶报告载体，B葡萄糖醛酸酶报告载体，碱性磷酸酶 报告载体，绿色荧光蛋白报告载体以及荧光素酶
5、报告载体.其中荧光素酶报告载体以其检测迅速、敏感和重现性好，被 广泛应用于启动子和增强子转录调控的研究4 . 在基因调控机制研究中，应用报告载体对可能调控哺乳动物基因表达 的基因元件进行定量分析是极为重要和必要的. 缺氧应答元件是对缺氧可做出应激反应的缺氧反应基因内一段小于 100bp 的单拷贝或多拷贝的顺式作用元件，能够与转录因子缺氧诱导因子1 结合，启动缺氧反应基因的转录，介导细胞对缺氧的反应5-6 . 本文将各种不同缺氧应答基因的HRE与CMVg动子组合成缺氧应答启动子，构建其荧光素酶报告 载体，快速对该遗传调控元件进行功能性分析.1 材料和方法材料TaqDN课合酶及Kpn I , Hi
6、ndm限制性内切酶购自 TaKaRa公司.质粒小量制备与纯化试剂盒、PCR试齐频勾自天为时代公司.Bgl n , Sgf I , IPpo I限制性内切酶和 pCIneo 真核表达载体、pGL3Basic 报告基因载体、JM109 菌种由Promega 公司提供.HREs 的正向和反向单链由博雅公司合成（两端带有限制性内切酶的粘端切口）. 引物由奥科公司合成 . 测序由基康公司完成. 其他试剂为进口或国产分析纯.方法退火合成的HRE单链用去离子灭菌水稀释成 3g/L ,退火 反应体系：正向单链 2以L,反向单链2以L, 1X退火液将总 体积补至50以L （退火液的配方： 醋酸钾g, HEPES
7、g KOHg 醋酸镁g,去离子水100mL溶解后高压蒸气消毒，备用） . 退火反应条件：95 5min 变性后，70 10min， 关掉水浴锅，缓慢降至4，过夜./CMV重组载体构建带有 Bgl n和Sgf I切口的HREE向 和反向单链退火成双链后定向克隆入经相应酶切去除CMV 曾大肠杆菌，挑选单克隆，提取重组质粒后对其行酶切鉴定，对符合预期值的克隆进行测序./CMV报告载体的构建以测序正确的HRE/CM逋组载体为模板，设计并合成含 Kpnl, Hindm限制性内切酶位点的引 物，采用PCR方法克隆HRE/CMVW控序列.PCR反应体系：2 x TaqPCRMasterMix,以 L; Pr
8、imeri , 1 以 L; Primer2 , 1 以 L; 质粒模板，1以L;总体积，25以L.PCR反应条件：95c 5min 变性后，95，30s， 68，45s， 72，45s， 30 个循环 .PCR产物经电泳凝胶回收后，进行Kpn I和Hind III双酶切，定向克隆入经相应酶切的萤火虫荧光素酶报告基因载体 pGL3Basic,转化至JM109大肠杆菌，挑选单克隆，提取重 组质粒后对其行酶切鉴定，对符合预期值的克隆进行测序.2 结果/CMV重组载体的鉴定合成的 HREE向和反向单链退火成 双链后，与酶切后的pCIneo 载体进行定向连接. 利用酶切对载体进行鉴定，选择 Bgl n
9、和IPpo I两个酶切位点，可得到 约 280bp 的片段 . 酶切后电泳如图1 所示，可见到与预期值相符的片段. 测序结果也与设计序列完全相同.M:DLXXmarker;16:HRE/CMV ( Bgl n IPpo I).图IpCIneoHRE/CMV勺酶切鉴定图(略)/CMV报告基因载体的鉴定以 HRE/CMVT组载体为模板进行PCR预期可获得约150bp的HRE/CMV专录调寸元件.如图2 所示，可见与预期大小相符的片段. 将回收的特异片段经Kpnl和Hind ID双酶切后克隆入 pGL3Basic ,转化后提取重组质粒酶切鉴定，如图 3 所示， 可见与预期大小相符的片段测序结果完全正
10、确.3 讨论作为报告基因，荧光素酶是一类能催化底物并发射荧光的酶家族. 包括细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶以及近年发现的海洋腔肠荧光素酶. 其中萤火虫荧光素酶克隆于北美洲萤火虫基因，它编码一条X 104的多肽链，其活性不需转录后修饰，无二硫键，不需要辅助因子和结合金属，几乎在任何宿主细胞中表达. 它能催化甲虫荧光素的氧化性羧化作用，发射出光子，可由光度计捕获并定量. 该酶半衰期很短，对于基因元件的诱导效应进行瞬间分析效果很好. 由于大多数生物缺少内源荧光，所以几乎无背景干扰. 鉴于此，萤火虫荧光素酶报告载体系统已广泛应用于不同启动子下外源基因表达强度和转录调控作用的研究. 报告基因分析系统一般需要2 个不同的报告载体同时转染细胞，一个标化转染效率，作为内参照；另一个测定启动子调控活性. 萤火虫荧光素酶和海洋腔肠荧光素酶这2 种报告载体具有兼容的化学特性、操作条件、速度、灵敏度、线性范围和仪器需要，使用标准光度计即可迅速完成测试.（作者：3COMM知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系service 立即删除）