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1、柴胡有效成分提取工艺研究 肖功胜，王启帅, 杨云*， （河南中医学院药学院，河南 郑州 450008） 摘要：目的：确定柴胡有效成分提取的最佳工艺。方法：以柴胡中挥发油吸收度和柴胡皂苷a的含量为指标，采用单因素试验筛选主要因素和水平，再以正交试验筛选柴胡有效成分提取最佳工艺。结果：最佳工艺参数为40温浸，收集相当于药材2倍量蒸馏液，继用8倍量含5%氨水的95%乙醇回流1h提取柴胡皂苷，可使挥发油吸收度达0.941，柴胡皂苷a的含量达0.32%。结论：该工艺为柴胡有效成分的提取提供了可靠依据，且工艺条件稳定可靠，重复性好。关键词：提取工艺；柴胡皂苷a；挥发油；正交试验Study on Extra
2、ction Technology of Active Ingredients from Bupleurum chinense DCXIAO Gong-sheng,WANG Qi-shuai,YANG Yun * （College of Pharmacy, Henan University of traditional Chinese medicine, Zhenzhou 450008.China ）ABSTRACT OBJECTIVE To determine the optimum technology of active ingredients from Bupleurum chinens
3、e DC. METHODS With the absorbance of volatile oils and the content of in Bupleurum chinense DC as indexes, selecting the major influencing factors and levels by the single factor experiment, and selecting the optimum technology by orthogonal experiment. RESULT The optimum condition shows the impregn
4、ating temperature is 40 ,the volume of distilled fluid is 2 times of weight of Bupleurum chinense DC, and the volume of 95%alcohol with 5%ammonia water to reflux extraction for 1hour is 8 times of weight of Bupleurum chinense DC, then the absorbance of volatile oils is 0.941 and the content of saiko
5、saponin a is 0.32%.CONCLUSION The optimum technology provides reliable evidence for extraction of active ingredients from Bupuleurum chinense DC, and the conditions are accurate and reliable with good reproducibility。KEY WORDS：Extraction technology; saikosaponin a; volatile oils; orthogonal experime
6、nt基金项目：国家十一五科技支撑计划资助项目（2006BAIO6A10）作者简介：肖功胜（1982），男，湖南邵阳人，硕士研究生，从事天然药物化学研究。*通讯作者：杨云，女，硕士生导师，教授。Tel:037165680605 E-mail:xiaogongsheng柴胡为伞形科植物柴胡（ Bupleurum chinense DC）或狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Wild）的干燥根1。具有疏散退热，疏肝解郁，升阳举陷之功效，为中医治疗少阳症的首选要药。其主要化学成分为柴胡皂苷和挥发油类。柴胡作为临床常用药，中成药制剂品种众多，且大多以煎煮法提取柴胡皂苷类成分，
7、而多以水蒸气蒸馏法提取挥发油2，由于柴胡皂苷a、d化学结构均具不稳定性，遇酸或受热易分别降解生成活性较弱的次生苷b1、b2，因此随着水蒸气蒸馏法提取时间的延长，柴胡皂苷a、d的量将逐渐降低，以致严重影响了柴胡制剂的质量和临床疗效。目前国内关于柴胡提取工艺的文献报道较多，但多以挥发油或柴胡皂苷a单独为指标进行考察，很少有同时考察挥发油和柴胡皂苷a的文献报道，更是未曾有文献报道过在保证挥发油提取率的同时还兼顾柴胡皂苷a的充分提取。因此，本文采用正交试验综合考察柴胡中挥发油吸收度和柴胡皂苷a含量，筛选最佳工艺，为提高柴胡制剂的质量和疗效打下坚实基础。1 仪器与试药1.1仪器岛津LC-20A高效液相分
8、析仪（SPD-20A紫外检测器）；752紫外分光光度计（上海精密仪器科技有限公司）；RE 5286A 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；METTLER AE240电子分析天平（瑞士）1.2试药柴胡药材购于河南省药材公司，经本院陈随清教授鉴定为伞形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC）的干燥根，柴胡皂苷a对照品自制，经峰面积归一化测定含量为：99.91% ；乙腈为色谱纯；水为双重蒸馏水；其他试剂均为分析纯。2方法2.1 单因素试验 分别以药材浸渍温度、浸渍时间、料液体积比、蒸馏液收集量等为因素，在不同水平下进行单因素试验，筛选出影响柴胡挥发油提取的主要因素和水平，同样分别以乙醇
9、浓度、PH值、柴胡皂苷提取时间、料液体积比等为因素，在不同水平下进行单因素试验，筛选出影响柴胡皂苷的提取的主要因素和水平。从而为正交试验设计提供依据。2.2挥发油的提取和测定方法随机称取50g柴胡干燥粗粉，置于500ml圆底烧瓶中，采用水蒸气蒸馏法在不同条件下提取柴胡挥发油，收集蒸馏液，加3%丙二醇摇匀，精密量取上述蒸馏液2ml两份，一份置5ml容量瓶中，加水定容，摇匀，作为样品液，另一份置蒸发皿中，置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水溶解，转移至5ml容量瓶中，加水定容，摇匀，作为空白。用752紫外分光光度计在277nm波长处测定蒸馏液中挥发油的吸收度。2.3柴胡皂苷的提取取提取挥发油后的药渣，滤干，
10、置于500ml圆底烧瓶中，在不同条件下回流提取柴胡皂苷，过滤得滤液,减压低温浓缩成每1ml含0.5g柴胡的浓缩液,备用。2.4柴胡皂苷a 含量测定2.4.1色谱条件大连伊利特C18(4.6mm250mm,5m)；流动相：乙腈-水37：63；流速：1ml/min；检测波长208nm；柱温：35；进样量20l.2.4.2 对照品溶液的制备精密称取柴胡皂苷a对照品5.09mg，加甲醇溶解并定容至10ml，摇匀，配成0.509mg/ml对照品溶液,冷藏备用。2.4.3 供试品溶液的制备取上述浓缩液10ml减压蒸干，加20ml甲醇溶解残渣，过滤得滤液。再取2ml滤液至10ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，
11、冷藏备用。 2.4.4 线性范围考察 精密吸取对照品储备液2.0、6.0、10.0、14.0、18.0l，在“2.4.1”项下色谱条件下进样测定,记录峰面积，以峰面积积分值Y为纵坐标，对照品溶液进样量X（l）为横坐标，进行线性回归（n=5）, 得线性回归方程为Y=209413.7X162379.4，线性范围为：0.9720 9.635g，相关系数为r=0.9997，线性关系良好。2.4.5 精密度试验 精密吸取对照品20l，在“2.4.1”项下色谱条件下重复进样5次测定，记录峰面积，RSD为1.5%（n=5），表明精密度良好。2.4.6 稳定性试验 将供试品溶液在室温下贮存，在“2.4.1”项
12、下色谱条件下，分别于0，2h，4h，6h，8h进样测定，记录峰面积，RSD为2.0%，表明样品在8h内稳定。2.4.7重现性试验 精密称取同一批样品5份，按供试品溶液处理方法制备样品溶液，在“2.4.1”项下色谱条件下重复进样测定5次，记录峰面积，RSD为2.1%（n=5）2.4.8样品测定精密吸取20l样品溶液，在“2.4.1”项下色谱条件下进样测定，记录峰面积，计算各样品中柴胡皂苷a的含量。2.5正交试验以柴胡蒸馏液中挥发油的吸收度和柴胡皂苷a的含量为检测指标，参照单因素试验结果，分别以药材浸渍温度、挥发油收集量、柴胡皂苷提取时间、柴胡皂苷提取溶剂料液比等主要因素及不同水平进行（L9(34
13、)正交设计，筛选最佳工艺。正交试验因素和水平见表1 表1 正交试验因素及水平 Tab1 Factor and level of orthogonal test因素水平因素浸渍温度A收集量B提取时间C料液比D1402倍1h5倍2604倍2h6倍3805倍3h8倍3结果与分析3.1 浸渍温度对挥发油提取效果的影响分别在30、40、60、80温度下浸渍6h,料液比1:6，提取一次，考察浸渍温度对挥发油提取效果的影响。测得吸收度依次为：0.303、0.984、0.758、0.587。由测定结果可知，在40下浸渍吸收度达到最大。且变化显著，所以浸渍温度应选在40左右。3.2浸渍时间对挥发油提取效果的影响
14、在40下，分别浸渍0h、2h、4h、6h、8h,料液比1：6，提取一次，考察浸渍时间对挥发油提取效果的影响。测得吸收度依次为：0.470、0.559、0.650、0.940、0.722。由测定结果可知，浸渍6h吸收度最大，浸渍4h和8h吸收度相当。3.3料液比对挥发油提取效果的影响料液比分别为1：5、1:6、1：8、1:10,提取一次，考察料液比对挥发油提取效果的影响，测得吸收度依次为：0.316、0.443、0.337、0.258。由测定结果可见，料液比1：6吸收度最大。且变化显著。3.4挥发油收集量对挥发油提取效果的影响分别收集100ml、200ml、300ml蒸馏液，考察挥发油收集量对挥
15、发油提取效果的影响，测得吸收度依次为：0.454、0.507、0.596。由测定结果可知。随着收集量的增多，吸收度逐渐增大，但增加趋势不显著。3.5乙醇浓度对柴胡皂苷提取效果的影响分别以95%、75%、60%、45%乙醇，料液比为：1:6，提取柴胡皂苷。考察不同乙醇浓度对柴胡皂苷提取效果的影响，柴胡皂苷a含量依次为：0.20%、0.15%、0.12%、0.12%。由测定结果可知，柴胡皂苷提取率随乙醇浓度的降低而降低。在95%乙醇浓度时最大。且变化较显著。因此选用95%乙醇提取。3.6 PH值对柴胡皂苷提取效果的影响分别用0、5%、10%、15%的氨水95%乙醇液提取皂苷。考察PH值对柴胡皂苷提
16、取效果的影响，柴胡皂苷a含量依次为：0.20%、0.25%、0.24%、0.24%。由测定结果可知，碱性乙醇提取效果比较好，含5%10%氨水95%乙醇条件下提取液中柴胡皂苷a变化不显著，因此选用含5%氨水。3.7提取时间对柴胡皂苷提取效果的影响 用95%乙醇分别在0.5h、1h、2h、3h、提取皂苷。考察提取时间对皂苷提取效果的影响。柴胡皂苷a含量依次为：0.20%、0.25%、0.20%、0.20%。由测定结果可知，提取1h时提取率最大。提取时间再长提取率就逐渐下降。3.8料液比对柴胡皂苷提取效果的影响 在10倍、8倍、6倍、5倍、3倍不同料液比条件下回流提取柴胡皂苷。考察料液比对柴胡皂苷提
17、取效果的影响。柴胡皂苷a含量依次为：0.15%、0.15%、0.20%、0.21%、0.14%。由测定结果可知，料液比为在5倍时提取率最大。3.9 正交试验结果与分析3.9.1 综合评分标准:因柴胡中的挥发油和柴胡皂苷a均为有效成分,权重应相等。则规定吸收度中最大值0.945及柴胡皂苷a含量中最大值0.33%为100,其余值对应比较,两项加和后平均得综合评分值,结果见表2,方差分析见表3。表2 正交试验结果与分析Tab 2 Result of orthogonal test试验号列号试验结果综合评分1234因素吸收度含量（%）y(%)ABCDy1y211（40）1（2倍）1（1h）1（5倍）0
18、.9450.2486.2621（40）2（4倍）2（2h）2（6倍）0.470.2766.2231（40）3（5倍）3（3h）3（8倍）0.5730.2873.8442（60）1（2倍）2（2h）3（8倍）0.7180.3287.9352（60）2（4倍）3（3h）1（5倍）0.4350.2256.0362（60）3（5倍）1（1h）2（6倍）0.6330.2469.0673（80）1（2倍）3（3h）2（6倍）0.540.2971.7983（80）2（4倍）1（1h）3（8倍）0.4680.3374.7693（80）3（5倍）2（2h）1（5倍）0.4650.2664综合评分Ij226.32
19、245.98230.08206.29j213.02197.01218.15207.07j210.55206.9201.66236.53Rj5.2616.329.4710.08表3误差分析Tab 3 Error analysis方差来源离均差平方和自由度方差F值显著性A 47.962 23.981.00B 447.012223.5059.32显著C135.772 67.8852.83D198.11299.0554.13一般显著由表2和表3可知，收集量的极差最大，其次是料液比和提取时间，故对于柴胡提取效果影响的大小顺序为BDCA,由于A和C影响不显著，故综合考虑，选择最佳提取方案为A1B1C1D3
20、，即40浸渍，收集100ml挥发油，8倍量含5% 氨水的95%乙醇提取1h。3.10最佳方案的验证实验取50g柴胡粗粉置500ml圆底烧瓶中，在最佳提取条件下提取。重复两次。验证实验结果见表4表4 验证实验结果Tab 4 Result of verification test实验次数 挥发油吸收度柴胡皂苷a的含量1 0.9380.33 2 0.9430.32 平均值 0.941 0.32由表4可见，采用优化最佳工艺提取有效成分柴胡挥发油和皂苷，其挥发油吸收度和柴胡皂苷a的含量都较高，且工艺条件稳定可靠，重复性好。4 讨论4.1 柴胡挥发油和柴胡皂苷为柴胡的主要有效成分，二者的提取是较为矛盾的。
21、据文献资料，柴胡皂苷在6h内稳定，而要完全提取挥发油则要较长时间。这将导致柴胡皂苷的分解、降解等一系列不稳定的反应，使柴胡皂苷的含量降低。因此要同时兼顾挥发油和柴胡皂苷的提取，可考虑采用水蒸气蒸馏法提取柴胡挥发油，采用碱性醇提工艺代替传统的水提工艺提取柴胡皂苷。且在提取过程中发现，柴胡皂苷a受热容易分解，随着加热时间增长，含量逐渐减少，因此在各加热环节，如提取，浓缩，干燥过程中应尽量采用低温，以减少柴胡皂苷a的损失。4.2 中药成分复杂,应综合考虑各有效成分的性质及其在制备过程中的变化,以保证制剂的质量和疗效。据文献资料，柴胡中含柴胡皂苷a大约在0.20.4%，从本试验最佳工艺提取液中测得柴胡
22、中柴胡皂苷a的含量为0.32%，因此本工艺提取效果较好。至于挥发油的含量，各种文献所得结果不尽相同，甚至相差10倍以上，由于药材的原因，如药材部位，采收时间，产地等的影响；难以衡量。因此本实验在不影响挥发油提取的前提下还兼顾了柴胡皂苷a的提取。从而为柴胡的提取提供可靠的依据和参照。REFERENCES1 Ch.P 2005 Vol I（中国药典2005年版，一部）S. 2005：198.2YANG Y. Chemical composition of natural medicine extraction and separation Manual (revised edition) M.Beijing: China Publishing House of Chinese medicine(中国中医药出版社), 2002：612615.