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1、华南师范大学实验报告专 业： 材料化学 年 级：2008级课程名字：近代材料分析测试技术 实验项目：高效液相色谱法实验类型： 验证 实验时间：2011年3月25日实验二 高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因一、目的要求1、学习高效液相色谱仪的操作。2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。二、基本原理咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因约为1.21.8%，茶叶中约含2.04.7%。可乐饮料、APC药片等中均含咖啡因。其分子
2、式为C8H10O2N4，结构式为：定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间tR和峰面积A后，可直接用tR定性，用峰面积A作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。三、仪器和试剂1、Agilent 1100高效液相色谱仪。2、色谱柱：Kromasil C18，5 1504.6mm。3、流动相：30%甲醇（色谱纯）+70%高纯水；流动相进入色谱系统前，用超
3、声波发生器脱气10min。4、 咖啡因标准贮备溶液：将咖啡因在110下烘干1h。准确称取0.1000g咖啡因，用二次蒸馏水溶解，定量转移至100mL容量瓶中，并稀释至刻度。标样浓度1000gmL-1。5、 测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。6、 20L平头微量注射器。四、实验内容1、 标准贮备液配制质量浓度分别为20、40、60、80gmL-1的标准系列溶液。（1mL，2mL，3mL、4mL稀释为50mL）2、 谱仪器条件：泵的流速：1.0mL/min；检测波长：275nm；进样量：10L；柱温：室温。3、 仪器基线稳定后，进咖啡因标准样，浓度由低到高。4、 品处理如下：（1）将约25mL可口
4、可乐置于一100mL洁净、干燥的烧杯中，剧烈搅拌30min或用超声波脱气5min，以赶尽可乐中二氧化碳。（2）准确称取0.04g速溶咖啡，用90蒸馏水溶解，冷却后待用。（3）准确称取0.04g茶叶，用20mL蒸馏水煮沸10min，冷却后，将上层清液，并按此步骤再重复一次。将上述三种样品分别转移至50mL容量瓶中，并定容至刻度。5、 上述三份样品溶液分别进行干过滤（即用干漏斗、干滤纸过滤），弃去前过滤液，取后面的过滤液，备用。6、 别取5mL可乐、咖啡饮料和茶叶水用0.45m的过滤膜过滤后，注入2mL样品瓶中备用。7、 “Agilent 1100高效液相色谱仪操作规程”分析饮料试液。五、结果处理
5、1. 测定每一个标准样的保留时间（进样标记至色谱峰顶尖的时间）。2. 确定未知样中咖啡因的出峰时间。3. 求取样品中咖啡因的浓度。记得实验结果如下：序号标样浓度gmL-1保留时间tR色谱峰面积S色谱峰高度H1205.037706020416742405.0371297842711673605.0861737510962724805.07120737821106235茶叶5.1201646966943306百事可乐5.09821481241179647速溶咖啡5.18543157125125将标样的数据利用EXCEL软件绘图，并计算回归方程，如下：将茶叶、百事可乐、速溶咖啡测试所得的峰面积代入回
6、归方程计算浓度：标样色谱峰面积S浓度gmL-1茶叶164696658.5039百事可乐214812480.56676速溶咖啡4315714.997623六、注意事项1、不同的可乐、茶叶、咖啡中咖啡因含量不大相同，称取的样品量可酌量增减。2、若样品和标准溶液需保存，应置于冰箱中。3、为获得良好结果，标准和样品的进样量要严格保持一致。七、思考题1、用标准曲线法定量的优缺点是什么？答：标准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。标准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量
7、，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。2、根据结构式，咖啡因能用离子交换色谱法分析吗？为什么？答：不行。因为离子交换色谱以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。平衡常数K值越大，表示组分的离子与离子交换树脂的相互作用越强。由于不同的物质在溶剂中离解后，对离子交换中心具有不同的亲合力，因此具有不同的平衡常数。亲合力大的，在柱中的停留时间长，具有高的保留值。依据咖啡因的结构式1,3,7-三甲基黄嘌呤或3,7-二氢-1,3,7三甲基-1H-嘌呤-2,6-二酮，其解离常数很小，不符合离子交换色谱的要求。4、在样品干过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果？为什么？答：干过滤主要是保持溶液浓度不变而采取的一种过滤方法，前液中可能有一些滤纸或滤膜上的杂质存在，为了保持溶液浓度不变，所以要将前液去掉。干过滤为分离掉溶液中的固体,并且不改变溶液浓度而采取的一种方法。为保持溶液浓度不变。前段滤液要弃去，并且滤纸漏斗盛接的烧杯都要干的。这样做不会影响实验结果。