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1、题目：秀丽线虫生殖细胞凋亡检测实验目的:1. 掌握检测凋亡细胞的方法2. 学习使用荧光染料活体染色的方法和步骤实验原理1. 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans ):是一种无毒无害、可以独立生存的线虫。其个体小，成体仅1.5mm长，为雌雄同体(hermaphrodites ),雄性个体仅占群体的 0.2%,可自体受精或双 性生殖；在20C下平均生活史为 3.5天，平均繁殖力为 300-350 个；但若与雄虫交配，可产生多达1400个以上的后代。1976年，Sulston 和 Horvitz 利用秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans ) 研究发现，其约
2、13%勺体细胞在胚胎发育中注定死亡，使得人们认识到细胞凋亡的遗传基础。2. 荧光染料活体染色：本实验使用吖啶橙( Acridine orange )作为染色剂，该染料对细胞具有慢性毒性，致癌性强，由于凋亡细胞因DNA片段化可结合更多染料，荧光显微镜下呈亮绿色，可在荧光显微镜下快速方便的检测出，适用于多数品系。实验材料及设备1. 实验材料：a）各品系秀丽隐杆线虫：N2（实验组），ced-1:gfp （方法对照组），ced-3 （阴性对照）b）OP50c）M9培养基d）NGM培养基2. 实验设备：a）普通光学显微镜b）载玻片若干，盖玻片若干，铂金丝c）暗箱d）吸水纸、滴管等e）荧光显微镜四. 实验
3、方法及步骤1. 线虫接种、同步化2. 取样：在12孔板培养板上，每孔吸取 900卩L预先接入少量 OP50的M9培养基，每孔用铂金丝挑取培养2030条成体线虫3. 染色：向N2与ced-3品系中每孔加入 250卩g/mL吖啶橙100卩L,混匀后置于培养箱（避光）染色4560min。4. 方法对照组观察：向ced-1:GFP品系中加入1滴盐酸左旋咪唑， 麻痹线虫后在荧光显微镜下观察。5. 恢复：将已染色的线虫吸出置于 35mm培养基中，恢复4560min , 使摄入的含染料的 OP50非出。麻痹线虫并置于荧光显微镜下观察。6. 观察：上述三个品系用相同方法观察： 蓝光激发，在20倍物镜中，凋亡细
4、胞位于生殖腺臂弯转弯附近，呈亮黄色（染色时间长）或亮橙色（染色时间短）（ced-1:GFP组凋亡细胞呈亮绿色），未凋亡细胞 核为均匀的暗绿色。五. 实验结果（一）方法对照组:图i方法对照组荧光显微镜观察结果在方法对照组中可观察到 GFP蛋白标记的凋亡细 胞的阳性结果：在生殖腺臂弯转弯附近有亮绿色的空泡， 外沿颜色最深，内侧颜色浅，该品系无需染色，发出绿 色荧光的是标记ced-1蛋白的GFP蛋白,会聚集在凋亡 细胞细胞膜上。（二）实验组:图2实验组荧光显微镜观察结果在实验组中能观察到吖啶橙标记的凋亡细胞的阳 性结果：呈现亮橙色的细胞结构，在 20倍物镜中，凋 亡细胞位于生殖腺臂弯转弯附近，呈亮黄
5、色（染色时间 长）或亮橙色（染色时间短），未凋亡细胞核为均匀的 暗绿色。（三）阴性对照组:图3阴性对照组荧光显微镜观察结果由于ced-3为凋亡基因缺陷品系，所以在阴性对照 组中理论上不可能观察到凋亡细胞的阳性结果， 但是在 结果中仍然可以看到呈现亮橙色的细胞结构，有两种可 能：1.受损死亡的细胞2.染色时间过长，吖啶橙杀死细 胞，产生假阳性结果。六. 实验讨论1. 实验结论:本实验使用吖啶橙或 GFP蛋白标记凋亡细胞，使其在荧光显微镜下显示为亮绿色2. 讨论一：实验中有哪些注意事项?1. 吖啶橙有较强毒性，长时间使用吖啶橙染色会导致细胞死亡， 染色超过90min会增加假阳性。2. 吖啶橙有毒性
6、，实验过程中严禁直接接触皮肤，取用吖啶橙需 要在实验室专门的区域，所有接触了吖啶橙的实验器械都要集 中处理。3. 在取用线虫时，动作要轻缓，防止伤害线虫，如果确实感觉难 度太大，可以向培养基中加入少量无菌水或培养基，然后用吸 管吸取含有线虫的液体以吸取线虫。3. 讨论二：如何设置阳性对照？答：线虫研究的常用品系还包括 ced-1与ced-5，这两个品系的 特点是，因此，如果使用这两个品系作为阳性对照， 可以很容易的 在荧光显微镜下观察到凋亡细胞。4. 讨论三：ced-1:GFP组的作用是什么？答：该组为方法对照，作用是证明本次实验所用的吖啶橙标记凋 亡细胞的方法准确可靠，CED-1是跨膜蛋白，
7、在lim-7启动子作用 下，在鞘细胞表达，在凋亡过程中，CED-1:GFP蛋白簇聚于凋亡细胞周围，不需要染色，但用于其它品系需要进行遗传操作。七. 参考文献1 DOS REMEDIOS CG, CHHABRA D, KEKIC M, et al. Actin binding proteins: regulation of cytoskeletal microfilaments.J. 2(2):433-4732 翟中和，王喜忠，丁明孝等.细胞生物学M.高等理科教育，2004(1):123- 128.3 刘雪兰,孙菲菲,李培英，等.寄生虫基因功能研究的模式生物-秀丽隐杆线虫J. 中国兽 医杂志，2011,(8):63-65.DOI:1O.3969/j.issn.0529-6005.2011.08.025.