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1、降钙素原（PCT检测试剂盒（胶体金法） 主要生产工艺及反应体系的研究资料胶体金免疫检测技术是目前临床快速检测的常用方法之一。广州鸿琪光学科技有限公司结合国内外对降钙素原检测试剂盒在临床诊断中的应用情况开发了降钙素原（PCT定量检测试剂盒（胶体金法），结合 鸿琪公司开发的免疫胶体金读数仪对血清、血浆和全血标本中的降钙素原（PCTT进行定量检测。 一、 反应原理描述人降钙素原（PCT检测试剂（胶体金法）是一种不需要任何仪器设备的全血/血清/血浆检测法，采用胶体金免疫层析技术，试剂盒含有被预先包被在玻璃纤维上的胶体金标记的 抗PC仲克隆抗体（mAbl）以及固定于膜上测试区 （T）的抗PC仲克隆抗体（
2、mAb2）和质控区（C） 的相应抗体。测试时，将标本滴入试剂盒加样孔（ S）内，标本中如含有人降钙素原（PCT）,则标本 中的人降钙素原（PCT）分别与预先包被在玻璃纤维上的抗 PC仲克隆抗体（mAbl）结合，结合 物在毛细效应下向上层析，随后会被固定在膜上相应测试区的抗PC仲克隆抗体（mAb2）结合捕获，从而在相应测试区出现紫红色条带。如是阴性标本，则相应测试区内将没有紫红色条带出现。无论标本中是否存在人降钙素原（PCT）, 一条紫红色条带都会出现在质控区（C）内。质控区（C）内所显现的紫红色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准， 同时也作为试剂的内控标准。通过金标免疫分析仪检测
3、测试区（ T）显色深度，再经过保存 在卡壳上二维码上的定标曲线计算得到检测结果。胶体金标记的基本原理是胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金标记所用的主要原辅料有：抗PCT单克隆抗体（mAbl）、氯金酸、柠檬酸三钠，玻璃纤维。NC膜包被的基本原理是蛋白首先通过静电作用和硝酸素纤维膜结合，然后靠H键和疏水作用维持长时间结合。NC膜包被所用的主要原辅料有： 硝酸素纤维膜、抗PCT单克隆抗体（mAb2）和羊抗鼠IgG。二、主要生产工艺的各主要工序流程图蓝色工序在10万级洁净区内进行，其他工序在普通生产区。领料入
4、 库三、主要工序所用主要原辅料、具体步骤即每一步骤的具体实现方法该产品的生产工艺包括各种工作溶液的配置，胶体金标记物、包被抗原或抗体等浓度确定，胶体金标记物制备，检测线及质控线的制备等步骤，并通过产品的半成品检验和成品检 验两个质控过程来保证其质量符合产品质量标准。（一）各种工作溶液的配置1配标记用液体：胶体金制备： %（金酸（HAuC，水溶液100ml加热至沸腾，加入1%宁檬酸三钠1ml,混匀，煮沸5分钟，待胶体金溶液颜色由蓝经紫变红后，冷却即可。2配金标记物干燥基础液包被缓冲液为 10mM Tris-HCl , %BSA, % NaN3 2%l糖。3配包被用液体包被缓冲液为10mM Tri
5、s-HCl , 2%!糖。4配包被溶液对照线包被羊抗鼠IgG,包被浓度ml检测线分别包被抗 PCT单克隆抗体（mAb2）,包被浓度均为 ml喷量科l/cm ,电机速度511H乙（二）胶体金标记物、包被抗原或抗体等浓度确定1、胶体金标记物：分别以20ug/ml最终浓度将抗PCT单克隆抗体（mAb1）加入胶体金溶液中进行标记。2、检测线包被抗原浓度：用包被缓冲液稀释抗3、对照线包被浓度：用包被缓冲液稀释羊抗鼠（三）胶体金标记物的制备采用枸檬酸三钠还原法制备胶体金，选择PCT单克隆抗体（mAb2）,终浓度均为 ml。IgG,终浓度为ml。30nm胶体金颗粒用于标记，分别以20?g/ml最终浓度抗PC
6、T单克隆抗体（mAb1）加入胶体金溶液中。快速搅拌1分钟，再慢速搅拌15分钟。分别加入20%BSA搅拌5分钟，离心6分钟（ 4000转），吸去上清，沉淀以金标记物干燥基础液（原胶体金溶液体积的 1/10）重新悬浮。置2-8 C保存，在规定的保存期内使用。以金标记物干燥基础液对金标抗PCT单克隆抗体（mAb1）进行按一定比例稀释，然后利用喷金仪喷到玻璃纤维上，喷量“/cm ,喷笔口径为10mm将喷好的玻璃纤维放置烘房中, 37 2 C,干燥24小时。（四）检测线及质控线的制备取抗PCT单克隆抗体（mAb2）终浓度分别为 ml,喷量科l/cm ,电机速度511在硝酸纤维素膜上制备检测线，室温干燥；
7、取已确定使用的用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG,终浓度为ml,用同样方法制备控制线。检测线与控制线在NC膜上之间的距离约 壬 线的宽度约；前后均匀；并置温度 1526 C;温度0 30%干燥24小时以上。（五）半成品检验按批号抽取一定数量的半成品检测，对所抽样的半成品做准确性、最低检出量、线性、精密性、稳定性等性能方面的检测，应符合质量标准。（六）贴板、切条、装卡? ?在？温度1530C;湿度W 25标件下，将标记好的玻璃纤维、硝酸纤维膜、聚纸板、吸水纸、样品垫（经特殊处理，可过滤红细胞）等物组装，要求材料附着牢固，膜条切割应宽为土，然后装塑料壳。（七）定标利用公司内部校准品对试剂进行定标，定标曲
8、线保存到二维码中。（八）组装1）把二维码贴到试剂卡壳上，并将干燥剂、吸管等装入铝箔袋，封口。2）装盒。（九）成品检验成品做准确性、最低检出量、线性、精密性、稳定性等性能方面的检测，应符合质量 标准。四、主要工艺的确定1 .检测线包被浓度试验设计：固定加液量（ 喷量Wl/cm ,电机速度511HZ）,用包被缓冲液调整抗 PCT单 克隆抗体（mAb2）的包被浓度分别为 mg/ml、mg/ml、mg/ ml、mg/ ml,分别进行包被，晾 干后按正常生产工艺组装试剂条，分别以降钙素原最低检出量参考品ml和零浓度参考品加样测试，每个浓度参考品平行测试20次。计算零浓度参考品测试的吸光值平均数分别为M0
9、及计算它们的标准差 SD,计算ml参考品的测试平均值为 M1,若M1M0+2SD表明最低检测限w ml （ 95洲信区间）。试验结果：包被浓度M0+2SDM1mlmlmlmlml结论：当包被浓度分别达到 ml,最低检测限w ml,而进一步提高包被浓度，这个项目 的灵敏度没有明显的改变。最终确定这个项目检测线包被浓度均为mg/ml。2 .对照线包被浓度试验设计：固定加液量（ 喷量Wl/cm ,电机速度511HZ0 ,用包被缓冲液调整羊抗鼠IgG抗体浓度为 mg/ml、mg/ml、mg/ml、mg/ml、ml,分别进行包被，晾干后按正常生产 工艺组装试剂条，以阴性标本加样比较不同包被浓度对照线显色
10、时间。试验结果:羊抗鼠IgG对照线显色时间ml超过4 minml超过4 minml2minml2minml2min结论：包被浓度达到 ml,对照线即在2 min内清晰可辩，符合设计要求。最终确定对 照线包被浓度ml。3 .胶体金标记抗PCT单克隆抗体（mAbl）的制备胶体金与标记蛋白用量之比的确定试验设计：将胶体金分装15管，每管1ml,每个项目5管。将抗PCT单克隆抗体（mAbl） 分别以5g/ml、10g/ml、20科g/ml、30科g/ml、40科g/ml浓度加入上列胶体金溶液中， 快速搅拌1分钟，再慢速搅拌15分钟。加20%BSA搅拌5分钟，离心6分钟（10000转）， 吸去上清，沉淀
11、以金标记物干燥基础液重新悬浮。以金标记物干燥基础液对金标抗PCT单克隆抗体（mAb1）进行按一定比例稀释，然后利用喷金仪喷到玻璃纤维上，喷量6/cm ,喷笔口径为10mm将喷好的玻璃纤维放置烘房中， 372C,干燥24小时。按正常生产工艺组装试剂条。分别进行包被，晾干后按正常生产工艺组装试剂条，分别以降钙素原最低检出量参考品ml和零浓度参考品加样测试，每个浓度参考品平行测试 20次。计算零浓度参考品测试的吸光值平均数分别为 M0及计算它们的标准差 SD计算ml参考品的测试平均 M1,若M1M0+2SD 表明最低检测限w ml （ 95洲信区间）。比较不同标记蛋白用量的灵敏度高低。包被浓度M0+
12、2SDM1mlmlmlmlml结论：当标记浓度分别达到20 pg/ml,试剂盒能满足最低检出量参考品ml检出要求，而进一步提高包被浓度，这三个项目的检测线显色程度没有明显的改变。最终确定标记浓 度均为20g /ml。金标抗PCT单克隆抗体（mAbl）稀释浓度的确定试验设计：将抗 PCT单克隆抗体（mAbl）用金标记物干燥基础液按1: 1、1: 2、1： 3比例进行稀释，稀释好后按固定喷金参数，将金标抗PCT单克隆抗体（mAb1）喷在玻璃纤维上，干燥，按正常生产工艺组装试剂条，分别以降钙素原最低检出量参考品ml和零浓度参考品加样测试，每个浓度参考品平行测试20次。计算零浓度参考品测试的吸光值平均
13、数分别为M0及计算它们的标准差 SD计算ml参考品的测试平均 M1,若M1M0+2SD表明最低检测限w ml O 95洲信区间）。比较 不同标记蛋白用量的灵敏度高低。稀释浓度M0+2SDM11:11:21:3结论：只有当稀释度达到 1: 1时，最低检测限w ml,符合设计要求。最终确定金标单 抗稀释度为1:1。4 .设计定型通过以上实验，我们确定采用的生产工艺为：（1） NC膜包被：检测线：用包被缓冲液稀释抗PCT单克隆抗体（mAb2）到终浓度为 ml。对照线：用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG,终浓度为ml。包膜参数：喷量Wl/cm ,电机速度511HZ。将包被好的NC膜放置烘房中，372 C,干
14、燥24小时。（2）胶体金标记：以20?g/ml最终浓度将抗PCT单克隆抗体（mAbl）加入胶体金中。快速搅拌1分钟，再慢 速搅拌15分钟。加20%BSA搅拌5分钟，离心6分钟（ 4000转），吸去上清，沉淀以金标 记物干燥基础液重新悬浮。然后用金标记物干燥基础液分别按1: 1进行稀释，然后利用喷金仪喷到玻璃纤维上，喷量“/cm ,喷笔口径为10mm将喷好的玻璃纤维放置烘房中，372C,干燥24小时。按正常生产工艺组装试剂条。成品检验：组装成的试剂条是否在15分钟内检出降钙素原最低检出量参考品ml。成品检验结果：组装成的试剂条能在 15分钟内检出降钙素原最低检出量参考品ml。结论：该生产工艺生产
15、出来的试剂条符合我们的产品要求，确认为以后采用的生产工艺。五、质控标准及内部质控品的确立1 . 企业标准的制定的缘由由于目前人降钙素原的检测尚无一个统一的国家标准或国际标准，我们参考已上市的人降钙素原检测试剂盒产品的性能指标， 设计了本品的企业内部 标准，制定了内部校准品和质 控品。2 .质控标准准确性标准：取PCT零浓度参考品，作为基础样本，将其等体积分为4份，在任意3份中添加PCT纯分析物，使加入浓度分别为5ng/ml、15ng/ml、40ng/ml ,制成3份回收样本，分别计算其回收率，然后计算平均回收率，平均回收率应R95%最低检测限标准分别以降钙素原最低检出量参考品ml和零浓度参考品
16、加样测试，每个浓度参考品平行测试20次。计算零浓度参考品测试的吸光值平均数分别为M0及计算它们的标准差 SD计算ml参考品的测试平均 M1,若M1M0+2SD表明最低检测限w ml （ 95%1信区间）。最低检测限必须w ml。线性标准用50ng/ml的高浓度参考品和 ml的低浓度参考品，混合成8个稀释浓度（Xi）,每个浓 度测定3次，分别求出检测结果均值即为实测值（ Yi）。以稀释浓度（Xi）为自变量，以检 测结果实测值（Yi）为因变量求出线性回归方程。计算线性回归的相关系数（ r）及线性相 对偏差，要求线性相关系数rn,线性相对偏差不超过土 15%精密性标准批内：用同一批次试剂盒分别对企业
17、内部1ng/ml和40ng/ml PCT参考品进行检测，各平行测定10次，批内变异系数 CVC 15%批间：取三个不同批次的产品，分别测定企业内部1ng/ml和40ng/ml PCT参考品，每个批号重复检测10次，批间变异系数 Ca 20%3 .内部质控品的制备最低检出量质控品的制备和验证降钙素原零浓度质控品的制备和验证制备方法：10份经确认PCT为阴性、无肉眼可见的溶血、黄疸、乳糜颗粒，HIV抗体、HBM原、HCM体检测均为阴性的血清标本，进行混合。经离心、过滤等处理后，然后经 罗氏诊断产品（上海）有限公司的降钙素原检测试剂盒（电化学发光法）进行本测，确认PCT浓度为0ng/ml ,加2/万
18、叠氮钠，分装标识后，-20 C或以下温度保存，有效期 2年。验证方法：将降钙素原零浓度质控品按说明书于降钙素原检测试剂盒（胶体金法）上 加样检测，要求检测结果为vml,说明该质控标本可以作为本试剂盒的零浓度质控品。降钙素原定值质控品的制备和验证从Hytest公司购买PCT纯化品，用零浓度参考品作为基础液进行稀释，稀释到一系列 浓度，经罗氏诊断产品（上海）有限公司的降钙素原检测试剂盒（电化学发光法）检测，确认PCT浓度分别 ml、25ng/ml、50ng/ml、100 ng/ml 和 120ng/ml。力口 2/万叠氮钠，分装标识 后，-20 C或以下温度保存，有效期 3年。验证方法：将降钙素原零浓度质控品按说明书于降钙素原检测试剂盒（胶体金法）上加样检测，检测结果与靶值偏差V15%说明上述质控品可以作为本试剂盒的定值质控品。内部校准品的制备及溯源见附件1降钙素原公司内部校准品的溯源过程及定值可靠性验证六、样本要求全血/血清/血浆标本应收集在洁净、干燥不含有任何防腐剂的塑料和玻璃容器中，全血 /血 浆样本对临床常用抗凝剂（EDTA肝素钠、枸檬酸钠）无要求。 7天内，可保存于2-8 C冷 藏，长期保存需冷冻于-20 C,忌反复冻融。