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1、附件 6:体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则生物芯片类试剂生产及质量控制技术指导原则前言 本指导原则所定义的生物芯片诊断试剂是指将多个生物探针（包括片段 ,寡核苷酸 ,抗原,抗体,组织,细胞等 ）按预先设计的排列方式固定在特制的基质 （包括玻璃片 ,尼龙膜 , 硝酸纤维素膜等 ）上 ,用特定的方法提取生物靶分子并进行标记,然后与固定在基质上的生物探针特异性的结合 ,再用相应的检测设备 （如激光扫描仪检测仪等 ）和分析方法 （包括软件 ）进行检测 ,记录 ,分析 ,实现对生物靶分子的定性或定量检测的试剂 . 根据芯片制作的主要原料和方法 ,生物芯片可分为核酸芯片 ,蛋白芯片 ,细胞芯片 ,组
2、织 芯片 ,芯片实验室等 .本指导原则是针对核酸和蛋白为检测靶分子生物芯片的生产及 质量控制技术指导原则 ,其它类型靶分子检测的芯片诊断试剂可参考本指导原则.由于生物芯片技术还在不断发展 ,国家食品药品监督管理部门可依据科学技术发展 的需要 ,适时组织对本指导原则进行修订 .一, 基本原则（一）生物芯片诊断试剂生产用的物料包括 :原料 ,辅料和包装材料 .各种物料应当制定 相应的质量指标 ,并应符合有关法规的要求 .（二 ）生物芯片诊断试剂的生产企业应具备相应的专业技术人员,相适应的仪器设备和生产环境 ,获得医疗器械生产许可证 ;应当按照体外诊断试剂生产实施细则 （试 行 ）的要求建立相应的质
3、量管理体系 ,形成文件和记录 ,加以实施并保持有效运行 ;应 当通过体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）的考核 .（三）生物芯片诊断试剂的研制应当按照科学,规范的原则组织研发 ,各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理 .（四 ）生物芯片诊断试剂生产过程中所用的物料及工艺,应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜 .二, 物料质量控制（一）核酸检测芯片 核酸芯片检测时 ,从生物样本中提取的核酸可用荧光标记 ,金标记和酶标记 .检测方法 包括光谱学方法和化学显色 .下面为荧光标记芯片技术指导原则 ,采用金标记和酶联 显色等的生物芯片诊断试剂可参照核酸芯片和蛋白芯片相关部分 .1,
4、主要生物原料 核酸检测芯片的主要生物原料包括模板 ,引物,探针,标记物等 .应按照工艺要求对这类 生物原料进行质量检验 ,以保证其达到规定的质量标准 .主要生物原料的供应商要求 相对固定 ,不得随意变更供应商 .（1）模板 重组:经测序验证 ,关键位置没有错误 .1 溶解,浓度为 1以l上 20保存 .（2）（）纯级,无污染 20以下保存 .外购者,由生产厂家提供质量保证证明 ,达到生产要求 .（3）引物 序列确证 ;进行扩增后 ,克隆测序鉴定验证 ,建立引物标准品 .生产中的引物原材料为冻 干粉纯或纯 ,外购者 ,供应商应提供该产品的质检证明 ,如电泳结果或分析图谱 ;自己合 成的引物 ,需
5、有电泳结果或分析图谱 .用标准模板扩增 ,电泳检测 ,谱带单一 ,大小正确 , 与对照引物比较 ,产物量一致 .符合视为合格引物 20以下保存 .(4) 探针 (用于阵列制备 )重组, 冻干粉(或1溶解液):每种 90g以上,酶切鉴定分析图谱 . 产物,冻干粉(或1溶解液):每种 90g以上电泳鉴定图谱 .合成寡核苷酸纯或纯 ,每种 90g以上,提供该产品的电泳分析图谱或分析图谱 .外购者 , 供应商应提供质量保证证明 ,达到生产要求 .探针序列的正确性 :应用克隆鉴定的标准杂交鉴定或进行测序鉴定.外购者 ,供应商应提供质量保证证明 ,达到生产要求 .纯度和浓度检测 :用电泳方法 ,电泳图谱没
6、有杂带 ,目标条带的强度与已知浓度的标准 条带进行参比计算其强度 .纯度较高的 ,可用紫外分光光度计进行定量 .检定合格后入 库 .避光 20以下保存 .(5) 标记物 含有激发光波长和发射光波长介于 280680 的所有荧光分子纯 ,供应商应提供质量保 证证明.(6) 聚合酶检测 ,纯度 95%, 具聚合酶活性 ,无核酸外切酶活性及核酸内切酶活性,具热稳定性 ,94 1 小时后仍保持 50% 活性 ,由供应商提供质量保证 20保存 .(7) (尿嘧啶糖基化酶 ) 具尿嘧啶糖基化酶活性 ,无核酸外切酶及核酸内切酶活性.1U 37处理 3 分钟后,103拷贝以下含 U 模板被降解后 ,不能产生扩
7、增产物 ,供应商提供质量保证 20保 存.(8) 酶 具有逆转录活性 ,供应商提供质量保证 20保存 .(9) 酶具逆转录酶活性和聚合酶活性,无核酸外切酶活性及核酸内切酶活性,具热稳定性,941 小时后仍保持 50%活性 20保存.(10) 缓冲液各类酶制品需要的的反应缓冲液由厂家随酶制品提供,供应商提供质量保证 20保存.2, 主要生物辅料(1) 杂交液 购买成品者 ,供应商提供质量标准 ,并按要求保存 .自制杂交液 ,按半成品检定标准要求 进行检定 .(2) 酶类 蛋白酶,核酸酶等,供应商提供质量标准 ,并按要求保存 .(3) 核酸提取试剂 供应商提供质量保证 ,并按要求保存 .如果是自制
8、提取液 ,按半成品检定要求 .(4) 鱼精 供应商提供质量保证 ,并按要求保存 .(5) 封闭用蛋白 包括牛血清白蛋白 ,奶粉等 ,提供质量标准 ,并按要求保存 .3, 主要化学原辅料 参照中国生物制品主要原辅材料质控标准 (2000年版 )分析纯级别进行检验 .主要 的检测指标包括 :溶液外观 ,一般盐类检测 ,溶液值检测 ,溶解情况检测 ,干燥失重的检 测 ,炽灼残渣等 .主要化学原材料的供应商要求相对固定 ,不得随意发生变更 .化学原材料在购入时 ,原 材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质量质量保证材料和质量检验报告,其质量标准应达到生产所需的质量标准 .(1) 无机类 主要包括氯化
9、钠 ,氢氧化钠 ,纯化水等 .(2) 有机类主要包括有丙酮 ,乙醇,枸橼酸 ,吐温 20,乙二胺四乙酸二钠 ,氨基吡啉等 .(3) 特殊化学原料聚乙二醇 ,多聚赖氨酸 ,丙烯酰胺 ,甲叉双丙烯酰胺 - 四甲基二乙胺 (),溴化乙锭 (),染色 剂等.4, 其他物料(1) 载玻片 外观:明亮处用肉眼观察无缺刻 ,无划伤等 .规格按设计要求 .激光扫描仪扫描 (波长为芯片检测波长 ):包被层基本均匀 .(2) 试管,吸头,试剂瓶等一次性使用 ,由生产厂家提供质量保证 ,达到设计要求 .(3) 其他:说明书 ,包装外盒等 参照国家食品药品监督管理局颁布的体外诊断试剂说明书编写指导原则和医 疗器械说明
10、书 ,标签和包装标识管理规定执行 .(二) 蛋白检测芯片1, 主要生物原料 与生产的产品质量最密切相关的生物原料包括各种活性抗原,重组抗原 ,单克隆杭体 ,多克隆抗体以及多肽类生物原科 .这类原料可用于点膜 ,标记相关酶 ,纳米金 ,光学基团 及中和反应用抗原或抗体等 .使用前应按工艺要求对这类生物原料进行质量检验 ,以 保证其达到规定的质量要求 .主要生物原料若为企业自己生产 ,其工艺必须相对稳定 ; 若购买,其供应商要求相对固定 ,不能随意变更供应商 ,如果主要原料 (包括工艺 )或其 供应商有变更 ,必须进行原料验证 ,并进行补充申报 .主要生物原料的常规检验项目一般包括 :(1) 外观
11、肉眼观察 ,大部分生物原料为澄清透明的液体 ,不含异物 ,浑浊或摇不散的沉淀 ;或者为 白色粉末 ,不含有其他颜色的杂质 ;特殊生物原料应具备相应外观标准 .(2) 纯度和分子量 主要通过电泳和电泳结果扫描仪进行检测 ,也可用其他适宜的方法 ,如高效液相法等 . 作为免疫诊断试剂用生物原材料 ,用银染法染色后 ,纯度一般都要大于 90%;用考玛氏 亮蓝染色后 ;纯度一般都要大于 95 凝胶电泳法测定分子量 .(3) 蛋白浓度蛋白浓度可通过法 ,280光吸收法 ,双缩脲方法等进行检测 ;(4) 效价 效价的测定一般根据蛋白含量测定结果通过倍比稀释法进行.效价应达到设计规定的要求.(5) 功能性实
12、验 功能性实验是指生物原料用于试剂盒试剂实际生产中的情况,一般考查该原料使用后的试剂灵敏度 ,特异性和稳定性 .2, 主要生物辅料生物辅料指的是在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料,主要包括小牛血清 ,山羊血清 ,牛血清白蛋白和酪蛋白等 .这些生物原料均应按照中国生物制品主 要原辅材料质控标准 (2000 年版)所规定的质量标准要求进行检验 ,达到相应的质量 标准后方应用于生产 .生物辅料的供应商同样要求相对固定 ,不得随意变更供应商 . 对于小牛血清或山羊血清 ,牛血清白蛋白以及酪蛋白等 ,还应进行功能性实验 ,即以其 为原料配制 10%浓度的稀释液作为样品 ,进行酶联免疫测定 ,均
13、不得出现非特异性反 应.对于标记用酶 ,应在产品的质量标准中明示所使用的标记用酶的名称(如辣根过氧化物酶 ,碱性磷酸酶等 ),同时应根据不同生产厂家的检定方法和质量标准进行检验,酶的纯度值 (403280)应大于 3.0.3, 化学原辅料 参照中国生物制品主要原辅材料质控标准 (2000年版 )分析纯级别进行检验 .主要 的检测指标包括 :溶液外观 ,一般盐类检测 ,溶液值检测 ,溶解情况检测 ,干燥失重的检 测 ,炽灼残渣等 .主要化学原材料的供应商要求相对固定 ,不得随意发生变更 .化学原材料在购入时 ,原 材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质量质量保证材料和质量检验报告,其质量标准应
14、达到生产所需的质量标准 .(1) 无机类 主要包括氯化钠 ,氢氧化钠 ,纯化水等 .(2) 有机类主要包括有丙酮 ,乙醇,枸橼酸 ,吐温 20,乙二胺四乙酸二钠 ,氨基吡啉等 .(3) 特殊化学原料(联苯二胺 ),染色剂等 .4, 其他物料(1) 基质 以硝酸纤维素膜为例 :孔径符合设计要求 (0.45 m,0.22等m),均一性 (厚度及毛细迁移 速度20%),尺寸 (与标识吻合 )(2) 瓶子和干燥剂 由生产厂家提供质量保证 ,达到规定要求 .(3) 其他:说明书 ,包装外盒等 应参照国家食品药品监督管理局颁布的 体外诊断试剂说明书编写指导原则 和医 疗器械说明书 ,标签和包装标识管理规定
15、执行 .三, 试剂盒各组分的生产生物芯片主要包括芯片 ,蛋白芯片 ,组织芯片 ,细胞芯片以及芯片实验室等 .生物芯片诊 断试剂产品基本可分成二个部分 ,一部分是芯片 ,另一部分检测用工作液 .如果有配套 的检测仪器 ,还需对仪器及处理软件的应用加以说明 .(一)芯片的生产 芯片生产的基本过程包括探针的获取方法 ,纯化,点样 ,固定.1, 探针获取不同的芯片 ,主要是探针不同 ,生物芯片的探针主要包括以下几类 ,其它探针可参考制 定相应的技术及质量标准 .(1) 探针的获取 探针的形式有产物 ,克隆 ,人工合成片段等 ;要求有生产程序和质量指标及检测方法 ,要 进行纯化 ,有固定的纯化程序 .(
16、2) 抗原的生产抗原的获得方法包括细胞培养 ,从生物材料中分离提取 ,基因工程表达以及合成肽等 . 基因工程表达产物又分为纯抗原蛋白 ,融合蛋白等 .(3) 抗体抗体分单克隆抗体和多克隆抗体 .抗体制备包括细胞培养 ,动物腹水 ,基因工程表达等 方式 .(4) 细胞和组织 包括细胞或组织类型 ,固定方法 .组织材料还包括固定 ,包埋,切片等 .(5) 芯片实验室 ,包括各种管道泵的制作等 .2, 阵列的排列设计 阵列的排列包括依次排列 ,随机排列 ,对角线排列等 ,设计时需考虑重复次数等 .3, 点阵的制作 使用仪器的要确定型号 ,程序 ;手工制作的也要有标准操作程序 .4, 固定 :包括固定
17、方式 ,固定的条件等 .应对芯片生产的过程进行相应的质量控制 ,如点样和固定过程的监控 ,点样均一性检 验等.(二) 工作液配制1, 芯片生产所需试剂 ,包括细胞培养基 ,探针制备试剂 ,阵列制作和固定试剂等 .2, 样品处理试剂 ,芯片检测靶分子分为核酸和蛋白质 .检测核酸的样品处理试剂包括 临床取样提取或提取试剂 ,逆转录试剂扩增试剂 ,核酸标记试剂等 ;检测蛋白的处理试 剂包括取样试剂 ,蛋白稀释液以及特殊试剂等 .3, 反应液:检测核酸时的反应液包括预杂交液 ,杂交液,洗脱液等;检测蛋白时 ,包括封闭 液,抗原/抗体反应液 ,洗脱液 ,显色液 ,显色终止液等 .(三) 数据判读1, 判
18、断标准及依据 ,包括 值的确定依据 .2, 数据判读方式 :人工还是软件判读 .3, 如果是软件判读 ,应提供软件判断的科学依据 (包括生物学原理 ,数据获取原理和判 断实验是否成立的依据 )以及实验测试的原始报告 (或数据),并需要说明 :(1) 软件的来源 :购买或自己编制 ,是否获得注册等 .(2) 软件的用途 :包括对数据的分析 ,存储,解读,含义等 .(3) 软件的使用 :基本的使用程序 . 四,半成品质量控制(一)抽样 检验人员按批号抽取检定需要数量的半成品 ,作好标记 ,待检 .(二)质控品 可用克隆并测序鉴定的或经特异性鉴定的抗原 (或抗体 ).质控品的基质应尽可能与被 测物基
19、质相一致 .(三) 检定要求1, 芯片检定(1) 灵敏度 :最低检测限达到规定要求 .(2) 特异性 :应达到规定要求 .若进行全阴 ,全阳和交叉反应检测 ,全阴性检测应在没有 靶分子存在时 ,所有检测位点没有检测信号 ;全阳性检测应在加入足够量的靶分子 ,所 有检测位点均有检测信号 ;交叉反应检测时 ,用某一位点的靶分子检测 ,应只有该位点 有检测信号 ,其它位点不能有检测信号 .（3）精密性 （均一性 ）:用比最低检测限高一个数量级的质控品 ,重复检测 10次,判定结果 一致.考虑到芯片的多位点检测 ,因此要进行全位点和单个位点进行检测 .半成品检定可以 用克隆和鉴定的抗原和抗体作质控品
20、.2, 工作液的检定（1）物理检测 :外观颜色正常 ,没有杂质 .（2）质量检定 :用被检定的工作液检测标准样 ,检测结果达到预定要求 . 五,成品质量控制（一）生产批量 申报生产的批量每批原则上不低于 1000 人份.（二）抽样 检验人员按批号抽取检定需要数量的半成品 ,做好标记 ,待检 .（三 ）标准品 （参考品 ）应用国家标准品或参考品进行检定 ,若无国家标准品 （参考品 ）,可以使用企业参考品 但其标准不得低于第一家已经获得批准的该类试剂 .（四）检定要求1,灵敏度 :应达到规定要求 .2,特异性 :应达到规定要求 .3, 精密性 （均一性 ）:对某一样本 ,重复 10 次,对病种的定性检测结果一致 .4, 稳定性 （仅对蛋白芯片 ）37放置至少 3 天,灵敏度 ,特异性和精密度仍达到规定要求 .热加速破坏试验的时间 长短 ,可由生产单位根据不同产品在 37贮存与常温贮存 （28）中质量变化的相关 性来决定7 / 6