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1、技术问题问答技术 问题 问答序后为了更好的让广大客户了解ELISA试齐I盒操作过程中出现问题及原因，特将大家普遍认为比较容易出现的问题进行归纳、技术问题问答整理成册，弁回馈给广大的客户。本手册提到的问题均为分析手段， 弁未牵涉到具体实例，您 可以根据相应的具体问题进行具体分析。 在具体实验操作中，如 本手册中未体现，希望大家及时与我们取得联系。贵州勤邦食品安全科学技术有限公司技术问题问答问题与解答1 .药物残留实验前处理过程中实验耗材（如离心管、玻璃管）重复使用最 理想的洗涤方法是什么？实验完成后，先用流动自来水冲洗干净，再加入洗涤剂超声 2h,然后再用自来水冲洗干净，最后用去离子水清洗1到2
2、次，60c完全烘干后待用。建议：超高阳性样本所使用的离心管或玻璃试管不再重复使用。2 .药物残留检测实验中对水质的要求：三蒸水、蒸储水、纯净水还是去离 子水？理论来说这几种水都可以满足分析要求，但对于某些项目来说还是有一定的区别，最好使用去离子水和三蒸水，蒸储水和纯净水一般仅用于洗涤液的配置。3 .器具污染所造成的途径有那几种？检样过程中出现含量较高的阳性样品；实验器具没有清洗干净；高浓度标品贮备液保存不当造成污染。建议：容易被污染或者使用周期较长的实验器具，定期（3-5个月）更新一次。4 . ELISA方法可用于检测药粉样品吗？针对不同成分的样品，通过对应的样品前处理方法 ，消除干扰后，可以
3、用ELISA方 法进行检测，但应防止与药残实验交叉污染。5 .同样一个样品，称取两个样检测两次，两次值差别较大，是取样原因还是板间的变异？正常情况下，板孔间的变异不会对样本的检测结果造成绝对的影响；样品的取样、前处理过程和分析过程中的操作误差是影响结果差别较大的主要原因。技术问题问答6 .药物残留实验前处理样品过程中所用的氮气是不是可换用压缩空气？空气中的氧气是否会对药物产生氧化作用，进而影响试验结果？一般情况下需要检测的目标物是非常稳定的药物，可以用压缩空气替换氮气，药物的氧化在此不会产生，如有特殊药物有氧化情况，说明书上会有明确标注。7 .将肉中药物残留成份转移到提取液中，最佳的离心力、离
4、心时间是多少 （不同的试剂盒离心时间不一样）？一般情况下，转速 4500r/min,离心时间5min到10 min，离心力大于 3000g即可。8 .吠喃四项检测是衍生化孵育时间和孵育温度多少为最佳？37 c过夜孵育14到16h为最佳孵育环境，有实验证明过最低可以缩短至12小时，但对于高阳性样本来说可能会出现差异，建议使用14-16h.60c孵育3h需严格遵守孵育时间。若时间允许的情况下，建议使用37c过夜孵育， 以便使药物冲分衍生化，能有效提高高阳性样本检测结果的准确性9 .添加回收率的测定方法是什么？添加回收实验时，添加浓度多少为好？添加回收实验是验证整个实验过程检测结果的准确度。不同的试
5、剂盒的不同种类的样本，按照说明书中对应的样本前处理方法进行实验。在添加的时候尽量避免在最低检测限以内或者超出试剂盒曲线外的添加，建议添加的最适浓度参照所需检测目标药物在相应组织中的判定限或定量限。 同时，添加时根据具体的添加浓度对添加的高标进行 适当的稀释，保证添加的准确性。如硝基吠喃类药物组织的定量限为0.5ppb ,添加回收时0.5ppb为最适添加浓度。添加回收的体积公式：V=C*1000M/P，其中:V为添加的高标准体积（ul） ,C为添加的浓 度,P为高标准的浓度（ppb）,M为样本的质量（g）。10 .脂肪存在为什么会造成试验的假阳性率比较高？在提取过程中，容易造成乳化，对样本进行不
6、正常的浓缩，易与杂质混合难以分离。乳化后一般利用60 C水浴加热半小时，最好是先把上层有机相去除后再利用水浴加热较 好.第二种解乳化的方法是把整个乳化后的样本全部放入冰箱-20C急冻室急冻30min或更长，回温后去除上层有机相再次离心后去上清液，取下层进行分析。技术问题问答如氯霉素或其他在加入正已烷再加入复溶液进行操作时，可在加入正已烷后充分涡动1-2分钟，然后加入复溶液后涡动5-10S,即可在一定程度上防止乳化造成。又如硝基吠喃类代谢物的前处理中加入乙酸乙酯后形成乳化层，不易取到相应的量，可以在加入乙酸乙酯时，放大加入的量，然后取液相应增加，保证稀释倍数不变，也可在一定程度上防止乳化形成。1
7、1 .样品OD值落在药残标准曲线的那一区间值精确度最高？一般在第三和第四标准之间精确度较高，但是不同的试剂盒曲线的局部差异，精确区间会稍有变化。一般在曲线上的近似直线段范围内较为准确.12 . OD值偏低由什么因素引起的？整板OD值偏低：） 反应温度偏低；） 反应时间不够；, 洗板时间过长或次数过多；） 点板时环境温度过低；, 酶标仪故障波长错误；鸨光灯寿命将近，导致光强变弱）；, 试剂盒有效期已过或将过；, 某些试剂盒标准品需要稀释才能使用或试剂稀释倍数错误（如四环素类）；, 试剂盒中的某些试剂变质或污染；, 不同试剂盒混用，, 试剂盒的回温时间较短；, 试剂盒保存未按规定的方法或环境保存；
8、） 试剂盒处于极端条件下，比如放在贴着冰箱壁，试剂冻伤。样本的OD值偏低：? 样本的阳性太高（可做空白样本及阳性样本对照试验），? 某些试剂盒的样本需要调节P H的没有调节到需要的P H范围；? 某些试剂盒的复溶液需要稀释后才能使用的没有经过稀释；? 样本前处理时没有去掉上层有机相，加样吸取到上层有机相；? 样本被污染;技术问题问答? 样本与标准品的温度相差太多（样本温度低）；? 样本前处理时使用的水质量不合格；? 样本前处理过程中所使用的试剂质量有问题（可做试剂空白对照）；13 .样本的吸光度值为什么会超出曲线上最大OD值？? 标准品回温时间不够；? 样本中含有非样本基质的物质，如有机溶剂；
9、? 样本复溶液稀释错误或直接利用去离子水作为复溶液；? 标准1被污染；? 反应时间错误，导致标准品的OD值不上升而样本的OD值继续上升，注：此种情况下，样本的抑制率在100%-110%范围内，一般可以初步判断样本为阴性样本。若大部分样本的抑制率远超过110%,建议电话咨询或者重复实验。14 .氮吹仪为什么需要水浴或者铁浴？氮气或空气主要吹主要增加了液体与气体的接触面积，水浴或者铁浴加热是为了 使有机溶剂挥发的速度更快一些，以达到节约时间的目的。15 .样本检测结果在曲线之外如何判定？把处理好的样本液用复溶液进行梯度稀释后，再进行检测.使之OD值在曲线近似直线段范围内为最佳。16 .氮吹仪吹干步
10、骤为什么要 50-60C进行水浴或铁浴？有机溶剂的沸点一般在60-90C不等，而水浴的温度一般较溶剂的沸点略低为佳，故对于一般的有机溶剂，可以选用50-60 C的水浴进行加热.但对于某些沸点较高的试剂，比如乙睛等沸点在 80c以上的有机溶剂吹干的时候可选用65-70 C水浴进行加热.但是温度不宜过高.注：对于混合有机溶剂一般来说沸点会有所降低.相应的水浴温度也应稍微降低。17 .勤邦公司ELISA试剂盒的洗板液是否可以通用？勤邦ELISA试剂盒内20X洗涤液成份是相同的，不同试剂盒之间可以通用。 但是,技术问题问答建议不使用相隔时间较长的洗液，同时配置好的洗液在室温下放置一周后需重新配置。建议
11、：首先明确该试剂盒说明书上是否是20X洗涤液。18 .样本吹干后保存问题。样本吹干后建议立即进行复溶后点板，尽量不进行保存，如果确实需要进行保存的，首先请电话咨询，若能保存，最好是选择吹干后放置于2-8C冰箱进行保存，如果是已经复溶好的样本，需要用封口膜进行封口后方可放置于2-8C冰箱保存。另外有些样本是不能放置在玻璃里面进行保存的，如唾诺酮类药物吹干后不能进行保存，如果需要保存，则要复溶后转移到塑料瓶中方可放置于2-8 C冰箱进行保存。一般说来，样本保存时间不超过12小时。19 .试剂盒在保质期内OD值偏低，但标准品有梯度，可否继续使用？试剂盒在保质期内 OD值偏低可能是保存环境影响所致。若
12、实验数据标准品有梯度、 标准品1的OD值大于0.5,可以分析实验结果，但是实验结果只可做为相对判定依据， 而不能做为定量检测结果。20 .回收率长期偏高或偏低，是否正常？国家对试剂盒的回收率范围要求较宽(40%-130% ),如果在稳定的前提下出现试剂盒的回收率长期偏高或偏低是正常的，也可以做为判定依据。需要在检测结果的检测值除上回收率即是该样本的相对准确检测结果。如果有阳性样本的情况下，最好是使用确证后的阳性样本进行复核实验为佳。21 . ELISA方法在方法及操作均无问题的情况下，能否出现假阳性或假阴性？ELISA方法本身的特点是具有半定量的性质，一般允许有一定比例的假阳性(国 家要求在1
13、0%以下)，但是不能出现假阴性检测结果。22 .样本处理过程中出现稀释倍数问题时，如何计算？样本处理过程中出现的稀释均为：在无损失的情况下， 每毫升样本液中溶解的样本质量或体积，如2g样本在无损失的情况下处理完成后溶解于1ml样本液中，则表示该技术问题问答方法的稀释倍数为 0.5倍，如0.5g样本在无损失的情况下处理完成后溶解于1ml样本液中，则表示该方法的稀释倍数为2倍，如2g样本在无损失的情况下处理完成后溶解于0.5ml样本液中，则表示该方法的稀释倍数为0.25倍。23 .没有结晶水的试剂在配置溶液时，该如何换算？没有结晶水的试剂在配置溶液时，应该取该试剂需要的物质的量乘上分子量后才是需要
14、的试剂的重量。如：说明书上需要n g分子量为M1的有结晶水的物质，如果在没有的情况下，需要用分子量为M2的没有结晶水的物质代替时，则需要的分子量为M2的物质重量为 n*M2/M1 。24 .配置好的试剂保存问题。配置好的无机试剂一般可以保存2-3个月，保存环境可以选择在室温，避光，阴凉处进行密封保存；洗液、复溶液等与抗原抗体直接接触的试剂选择在2-8 C冰箱里进行保存；有机混合溶液或有机和无机混合溶液保存的时间原则上不能超过1个星期，室温保存，最好是现配现用。25 .标准曲线的线性要求达到多少为好？标准曲线的线性直接反应该实验的优劣，理论上应该无限接近1。在实际操作中主要还是以标准曲线判定为主
15、，相关系数判定为辅，在曲线较好的情况下，相关系数只要能达到0.98以上即可做为半定量检测结果判定依据。如果低于 0.98,如果标准曲线没 有问题的情况下也是可以作为相对定性进行判定。26 .点板时，加样量错误会导致结果如何？由于该方法为生物法， 其反应基理非常复杂， 如果加样的量错误， 可能会导致不可 预料的结果，建议具体问题具体分析，可电话咨询。27 .怎样降低实验器材对实验带来的干扰?严格按照国家规定对相应的实验器材进行实验操作。技术问题问答28 .如何根据颜色深浅进行延时或缩短时间？对于有经验的实验员来说，颜色与OD值的关系很容易进行把握，如果颜色所示的OD值达到一定的程度即可进行终止。
16、如果颜色过早达到一定的OD值范围，即可提前进行终止，反之则延长反应时间，但不得超过10分钟。29 .多残留与单残留试剂盒检测的特点。一般来说，如果对方要求的是某类药物总残留检测结果不得超过某个值时，则可以使用多残留检测试剂盒，交叉反应率越接近100%越好。如果对方要求的某种药物检测结果不得超过某个值时，则要使用单残留检测试剂盒，且交叉反应率越低越好。对于不得检出的药物来说一般使用单残留检测试剂盒，避免出现过高的假阳性。30 .点板过程中，稀释好的抗体工作液或酶标二抗工作液能存放多长时间？严格按照说明书进行操作，如吠喃妥因代谢物（CA036 ）试剂盒中抗体工作液和酶标二抗浓缩液混合后需要室温平衡
17、30min,又如链霉素（CA351 ）试剂盒中抗体工作液和酶标二抗浓缩液混合后需要立即加样。31 .如何避免假阴性，如何提高回收率？一般在试剂盒研发过程中，前处理方法研究的时候即会在假阳性与回收率之前取 一个平衡点，只要在实验操作过程中严格按照试剂盒说明书所提供的方法进行操作时一 般不出现假阴性现象。32 .回收率为什么有时会超过100%?在前处理样本的过程中，添加浓度的准确度、系统操作误差等因素都对回收率高 低有影响。同时，样本中的杂质也会对检测系统产生干扰，有时会出现回收率超过 100%的现象。33 .酶标仪中自带有曲线分析系统，还有必要用试剂盒专用处理软件吗？酶标仪一般应用于医院或医学上
18、，其自带的曲线分析系统主要针对医学上的需要配备，它的数学模型在兽药残留检测方面不太适用，所以建议使用试剂盒专用分析软件。技术问题问答34 .如果检测样本在说明书上未出现，可否采用其他样本的前处理方法代替？如果检测的样本在说明书上未出现，不可擅自用其它样本前处理方法代替，建议 先与技术部进行联系确证。35 .回收率能否验证实验过程以及数据的准确性？在没有确证样本对照的情况下，添加回收率是对操作准确性、 操作环境及分析试剂的评价指标之一。因此，回收率也是实验成功与否的一个重要判定依据。在ELISA检测方法实际应用过程中，回收率只是一个参考指标，其值只要稳定在 一定范围内，检测结果即具有参考性。36
19、 .吠喃类药物代谢物检测的前处理过程中，如果取上层2.5ml时上层不够取，如何解决？在正常操作情况下，如样本发生乳化会导致上述情况发生。一方面，可以提高离 心机转速、延长离心时间，以达到明显分层的目的；另一方面，可以把加入乙酸乙酯的 量扩大到10ml ,离心后取5ml吹干。37 .酶标仪的检测校正只能由官方部门来进行检测吗？所有仪器的检测校正均只能由官方部门来进行检测，并贴上检验合格标志后，方 可用来做检测实验。38 .吠喃类药物代谢物在做添加回收实验时，可否利用已衍生化的标准曲线的标准品进行添加？吠喃类药物代谢物在做添加回收实验时，必须经过一个衍生化的过程，使吠喃类药物代谢物变成其衍生物。建
20、立曲线的标准品均已是衍生物，如果直接用来添加，则衍生 化过程无法监控，故不能使用已衍生化标准品做添加回收实验。39 .反应时间是否必须严格按照说明书所示？由于试剂盒检测中的反应时间是经过大量实验后得到的，建议最好完全按照说明书所示的时间进行操作分析。技术问题问答由于受实验室实际操作环境温度等的影响，试剂盒显色反应时间可以根据实际显色情况酌情调整。40 .如果在做吠喃类药物代谢物的实验时，离心管的体积不够的情况，怎么 办?如果遇到离心管的体积不够的情况，可以在保持稀释倍数不变的前提下，把样本以及加入的试剂的量进行减半操作。减半操作后不会对样本的检测造成本质性的影响。另一种方法，可以在比较大的试管
21、中进行提取，在加入乙酸乙酯振荡后， 先静置一段时间，然后转移足量的上层有机相到适合的离心管中进行离心。41 .试剂盒分析所用的液体pH值一般要求多少？由于抗体、酶都是生物活性物质，强酸强碱都会导致失活现象，所以试剂盒分析用的液体一般要求为中性环境，pH值约在7.2-7.4之间。42 .加入终止液后多久进行读数比较合适？由于ELISA实验中所用到的都是生物试剂，而终止液为硫酸溶液， 故在加入终止液后最好是在 5min之内进行读数，如果放置时间过长，则会导致OD值呈不规则降低。 颜色深的孔内可能会出现黑色絮状物质，上述现象是由于生物聚合体在硫酸的作用下碳化造成的。43 .板孔在使用之前孔底部有小颗
22、粒物质，正常吗？一般在板孔底部包被有抗原物质，可能会存在板孔底部有小颗粒的情况，不影响正常检测。44 . 47.唯诺酮类药物、磺胺类药物多长时间能代谢完？每种药物在不同动物体内都有一定的代谢周期，具体代谢周期可参阅相关文献。45 .如果没有二氯甲烷时可否能用三氯甲烷代替？每个试剂盒的前处理方法都是经过大量实验后确定的，不能简单的用三氯甲烷代 替二氯甲烷进行实验。技术问题问答46 .加完正己烷和复溶液涡动离心后出现乳化现象怎么办？建议首选60c水浴5-10min后再离心，同时提高离心力。此外，可选择 -20度冷冻10min左右重复离心47 . 一次检测的过程中，其中有一两个样品第一次检测时是高阳
23、性样本，基 本不显色，第二次检测时是阴性，是什么原因造成的？点样的过程中出现跳孔板孔出现较大的变异系数样本在前处理的过程中被污染样本混合不均匀建议：出现高阳性的样本后应保留该样本液，与重新处理好的样本液一起点样分析。48 . 一次大批量的样本检测过程中发现所有的样本都为阳性，重复测定后发 现都是阴性，为什么？样品前处理过程中所用试剂被污染实验用水被污染标准曲线出现较大的异常建议：做空白对照。同时建议大家在进行大批量样本检测时带上空白对照。当实验室系统中的所用试剂出现变更的时候，需要针对每个项目进行空白实验对照。49 .当标准曲线6个点中有一个点出现明显的异常时，影响结果判断时，结 果怎么处理？
24、建议参照之前的实验数据和试剂盒内的质控报告，有选择性的去掉有异常的点，或者适当的更改该异常点的数据，先把能确定阴阳性的样本挑出来。针对部分样本含量在与异常点的关系较大，不好判断阴阳性的样本，建议重新处理，重新分析。50 .在检测的过程中，出现完全不显色的样本，是否能直接判断样本为阳性技术问题问答（样本的阳性判断限在曲线范围内）？建议最好不要.部分企业用单孔单样进行检测，出现跳孔现象的可能性比较大。最好能复检该样本，且进行双孔对照，确定样本的最终含量。51 .洗板的过程中怎样减少气泡的产生 ？在多道孔加样器的吸头量程足够的情况下，用吸二打一 ”的方式加洗涤液能有效的减少板孔内气泡的产生。在多道孔
25、加样器的吸头量程较小的情况下（小于等于3 0 0 ul）,用吸一打一“ 的方式加洗涤液，在保证所加洗涤液的量均一的基础上，还能有效的减少气泡的产生。52 .甩板中的注意事项有哪些？尽量甩到板孔内无明显液体悬挂的时候再拍板。甩板的速度尽量快，避免板孔内的液体对流，产生交叉污染。53 .这两天做了一次实验，发现四种试剂盒的 6个标准的OD值都低于0.6, 样品的OD值也低，我们都是按正常程序操作，试剂盒也是新的.为什么会 这样？跟酶标仪有关系吗？建议首先观察加入终止之前显色的深浅，若显色深，读数小，请您检查酶标仪滤光片的排列顺序选择用来读数的波长酶标仪内置灯54 . ELISA实验中OD值和检测结果有什么关系？ELISA实验中，OD值和检测结果成负相关关系。55 .试剂盒开封后的保存方法，标准品为什么在有效期内会失效，失效的原 因都有那些？试剂盒每次用完后，应立即放入4c度冰箱冷藏保存，注意在储存的过程中，避免试 剂盒紧靠冰箱内壁，防止因局部温度过底冻伤”试剂。造成试剂盒中的标准品在有效期内失效的主要原因来自污染.污染途径有多种，有技术问题问答试剂盒分装过程中的局部污染 ，使用过程中的污染等等。