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1、实验四细菌的分离培养及培养性状的观察在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞 分裂、繁殖而产生的后代。 分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。目的要求1 .学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。2 . 了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。3 . 了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。4 .掌握钓菌、纯培养及移植技术。操作步骤一
2、.需氧性细菌分离培养法1 .平板划线分离法菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划 线法（图4-1）和分区划线法（图 4-2）两种。划线法示意图见图4-3。（1）连续划线法图4-1连续划线法图4-2分区划线法以无菌操作用接种环直接取 平板上待
3、分离纯化的菌落。将菌种 点种在平板边缘一处，取出接种 环，烧去多余菌体。将接种环再次 通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板， 在平板边缘空白处接触一下使接 种环冷却，然后从接种细菌的部位 在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成 3040度 角，以手腕力量在平板表面轻巧滑图4-3划线分离示意图动划线，接种环不要嵌入培养基内划破 培养基，线条要平行密集，充分利用平 板表面积，注意勿使前后两条线重叠。 划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待 冷却后放置接种架上。培养皿倒置于适 宜的恒温箱内培养。培养后在划线平板 上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片 镜检为纯种后再接种斜面。（2）分区划线法（四分区划线
4、法）取菌、接种、培养方法与“连续划 线法”相似。分区划线法划线分离时平板分4个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最 大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使 4区线条与1区线条相平行，这样 区与区间线条夹角最好保持 120度左右。先将接种环蘸取少量菌在平板上1区划3-5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动6070度。灼烧接种环，待在平板边缘上冷却后，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第2次平行划线。第2次划线完毕，同时再把平皿转动约 6070度，同样依次在3、4区划线。划线完毕，灼烧接种环， 关上皿盖，倒置于 37c恒温
5、箱中培养24h后，在划线区观察单菌落。2 .倾注平皿分离法被检材料若含有两种或两种以上细菌时，可借助溶化的琼脂将细菌稀释，待琼脂冷凝后，分散的细菌就被固定在原地形成菌落.这样也能达到分得纯种的目的。根据材料中存在菌数的多少，倾注平皿前可将被检材料不稀释或用生理盐水作适当稀释。其具体方法如下：取三支预先准备的普通琼脂培养基试管，水浴加热融化，冷至约50C,用火焰灭菌接种环钓取待分离物接种至第一管内，充分摇匀后，自第一管取一接种环内容物至第二管，以同样方法自第二管移种至第三管。然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置于37 C温箱内培养24ho结果多数细菌在琼脂内生长成菌落，仅少数菌落出现在表面
6、，通常第一个 平板内的菌落数较多而密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。3 .芽胞需氧菌分离培养法如果被检材料中可疑有带芽抱的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤，置于 80c水浴箱中维持1520分钟，或85c加热10分钟，再进行培养。材料中若有带芽抱的 细菌仍可存活而生长繁殖，不耐热的细菌繁殖体则被杀灭。4 .利用化学药品的分离培养法(1)抑菌作用 有些药品对某些细菌有极强的抑制作用，而对另外一些细菌没有抑制 作用，所以可利用这种特性进行细菌的分离，例如通常在培养基中加入结晶紫或青霉素等化学药品来抑制革兰氏阳性菌的生长，以分离得到革兰氏阴性菌。(2)杀菌作用 将病料如结核病料用
7、15 %硫酸溶液处理，其他杂菌均被杀死，而结核 杆菌因具有抗酸性而存活。(3)鉴别作用 利用细菌对某种糖的分解能力，通过培养基中指示剂的变化来鉴别某 种细菌。例如远藤氏培养基可以用来鉴别大肠杆菌与沙门氏杆菌。5 .实验动物分离法被检病料中疑有某种病原菌存在，可将病料以无菌操作取出，放入灭菌乳钵或组织匀浆器内，加35倍量无菌生理盐水制成混悬液，吸取一定量混悬液注射(肌肉、腹腔、皮下 或静脉)入易感实验动物 彳寺实验动物死后，取其脏器，常可分离到纯的病原菌。例如，疑 有猪丹毒杆菌存在的病料，可注射于鸽体，鸽死后，再取其脾脏以分离猪丹毒杆菌，可得到纯培养。6 .琼脂斜面分离法取琼脂斜面3管，用接种环
8、蘸取欲检病料少许 (如为脏器，先将表面烧烙后，用灭菌解 剖刀切开，以灭菌接种环由切口插入、转动、钓取组织)，混合于第1管的凝集水中，再作斜面划线；然后抽出接种环，不经烧灼，继续在第2管、第3管斜面上作同样划线。划毕，置37c温箱中培养。经此法分离培养后，第2管的菌落较第1管为少，第3管的菌落更少，如此较易得到单个菌落，达到纯培养之目的。7 .琼脂平板涂布分离法被检病料如血液、腹水等，可用灭菌毛细吸管或吸管吸取12滴置于平板中央，用灭菌的L形玻棒作均匀涂布。如估计细菌数很多，可直接用火焰灭菌的接种环钓菌，并做分 区划线。如为脏器病料，可先作成乳悬液再行涂布；或取其一小块，用镣子夹住，表面烧烙后，
9、用灭菌刀切开，以其切面直接进行涂布，此法适用于含菌量较少的病料的分离。8 .营养肉汤分离法当组织病料中含病原菌少，或有抗菌药残留时，用上述琼脂斜面或平板分离法可能无菌 落长出，这时可以无菌操作剪取一小块病料直接投入肉汤，经37c培养，在肉汤中长出细菌后，再用琼脂斜面或琼脂平板分离。二、厌氧性细菌分离培养法细菌接种后，直接放在恒温箱内培养，可以使需氧菌与兼性厌氧菌生长繁殖；但对厌氧菌，则需将培养环境或培养基中的氧气除去，或将氧化型物质还原，降低其氧化还原电势， 才能生长繁殖。在有氧的环境下，培养基的氧化还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。为使培养基降低电势，降低培养环境的氧分压是十分必要的。现有的
10、厌氧培养法很多，主要有生物学法、化学法和物理学法，可根据各实验室的具体情况而选用。（一）生物学方法培养基中含有植物组织（马铃薯、燕麦、发芽谷物等）或动物组织（新鲜动物组织小片， 或加热的肌肉、心脑等），因组织的呼吸作用，以及组织中可氧化物质的氧化而消耗氧气（肌肉、脑磷脂中不饱和脂肪酸的氧化，碎肉培养基的应用），造成厌氧环境，以利于厌氧性细菌的生长繁殖。同时，组织中所含的还原性化合物（谷胱甘肽）也可使氧化-还原电势下降。此外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一环境中，则环境中的氧被需氧菌消耗，造成厌氧环境，也有利于厌氧菌的生长繁殖。1 .动物组织及其他物质加入法 在液体培养基内加入肝脏、肾脏等动物脏
11、器，因其中 的半胱氨酸的一 SH基极不稳定，为强还原剂，所以可利用此培养基进行厌氧培养，在培养 之前将肝片肉汤加热，以驱出空气，冷却，然后接种培养。2 .共栖培养法 将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一个平皿内，利用需氧菌的生长繁殖 将氧气消耗后，造成厌氧环境利于厌氧菌生长。其具体方法是将培养皿的一半接种消耗氧气 能力极强的需氧菌如灵杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌等。另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37c恒温箱中培养 23d,即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。（二）化学方法利用还原能力强的化学物质，将环境或培养基内的氧气消耗，或还原氧化型物质， 降低氧化-还原电势。1
12、.焦性没食子酸法焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收氧而造成厌氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖。通常100cm3空间用焦性没食子酸 1g及10%氢氧化钠或氢氧化钾 10m1。具体方法有下列几种：（1）平板培养法 将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板，取一小团直径约2cm的脱脂棉，置于平皿盖的内面中央，其上滴加0.5ml 10 %氢氧化钠溶液；在靠近脱脂棉的一侧放置0.5g焦性没食子酸，暂勿使两者接触。 立即将已接种的平板覆盖于平皿盖上，迅速用融化的石蜡密封平皿四周。 封毕，轻轻摇动平皿，使被氢氧化钠溶液浸湿的脱脂棉与焦性没食子酸 接触，然后置37c恒温箱中培养2448h后，取出观察。2 2） Buc
13、hner氏试管法（图4-4）取一大试管，在管底放焦性没食子酸0.5g及玻璃珠图4-4 Buchner氏厌氧培养法图4-5瑞氏厌氧培养法数个或放一螺旋状铅丝。将已接 种的培养管放入大试管中， 迅速 加入2% NaOH溶液0.5ml ,立即 将试管口用橡皮塞塞紧， 必要时 周围用石蜡密封。37c培养24 48h后观察。(3)瑞氏厌氧培养法(图 4-5) 将已接种细菌的培养管的脱脂棉棉塞在火焰中灼烧 灭菌后，塞入管中离培养基 11.5cm处，置适量焦性没食子酸于其上，加入 10%NaOH溶 液2ml,迅速用橡皮塞将管口塞紧，以胶泥或石蜡严密封闭置温箱中培养。(4)史氏厌氧培养法用图4-6所示的厌氧培
14、养皿，在皿底一边置焦性没食子酸，另一边置NaOH溶液，将已接种的平皿翻盖于皿上，并将接合处用胶泥或石蜡密封，然后摇 动底部，使氢氧化钠与焦性没食子酸混合，置温箱中培养。4-7)(5)平皿厌氧培养法置一片中有小圆孔的金属板于两平皿之间，上面的平皿接种细 菌，下面的平皿盛焦性没食子酸及氢氧化钠溶液，用胶泥封闭后置温箱中培养(图(6)玻罐或干燥器法置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，将培养皿或试管置于隔板上，并在玻罐内置美兰指示剂一管，从罐侧加入氢氧化钠溶液于罐底，将焦图4-6史氏厌氧培养法图4-7平皿厌氧培养法性没食子酸用纸或纱布包好，用 线系住，暂勿与氢氧化钠接触， 等一切准备好后，将
15、线放下，使 焦性没食子酸落入氢氧化钠溶 液中，立即将盖盖好，密封，置 温箱中培养。2.李伏夫(B.M.JIbBOB ) 氏法此法是利用连二亚硫酸 钠(Sodium hyerosulphite )和碳酸钠以吸收空气中的氧气，释放二氧化碳造成厌氧环境。其反应式如下:Na2s2O4+Na2CO3+O2 - Na2SO4+Na2SO3+CO2取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内(如是液体培养基，则直立于罐内)，最上端保留可容纳 12个平皿的空间(视玻罐的体积而定)，按玻罐的体积每1000cm3空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各30g,在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混
16、合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。若用无盖玻罐，可将平皿 重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐置于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭，如图4-8所示。3.硫乙醇酸钠法硫乙醇酸钠是一种还原剂，加入培养基中，能除去其中的氧或还原氧化型物质，促使厌氧菌生长。其它可用的还原剂包括葡萄糖、维生素C及半胱氨酸等。(1)液体培养基法将细菌接入含0.1%的硫乙醇酸钠液体培养基中，并加入美兰溶液作为氧化还原的指示剂，37c培养2448h后观察，在无氧条件下，美兰被还原成无色。(2)固体培养基法利用特殊构造的Brewer氏培养皿，可使厌氧菌在培养基表面生长而形成孤立的菌落。具体方法如下：先将Brewer氏培养皿干热
17、灭菌，将溶化冷却至50c左右的硫乙醇酸钠固体培养基倾入皿内。待琼脂冷凝后，将厌氧菌接种于培养基的中央部分。盖上皿盖，使皿盖内缘与培养基外围部分相互紧密接触(图 4-9)。此时皿盖与培养基中央部 分留在空隙间的氧气被硫乙醇酸钠还原，美兰指示剂逐渐褪色， 而外缘部分，因与大气相通，图4-8李伏夫氏厌氧培养法图4-9 Brewer 氏培养皿仍呈蓝色。将 Brewer氏培养皿于37c恒温箱内2448h后观察。图 4-10 Mc1gtoshFildes二氏厌氧罐（三）物理学方法利用加热、密封、抽气等物理方法，以驱除或隔绝环境及培养基中的氧气，造成厌氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖。1 .厌氧罐法常用的厌氧
18、罐有 Brewer氏罐、Brown氏罐和Mclgtosh Fildes二氏罐（图4-10）。将接种好的厌氧菌培养皿依次放于厌氧罐中，先抽去部分空气，代以氢气至大气压。通电，使罐中残存的氧与氢经受钳或铝的催化而化合成水，使罐内氧气全部消失。将整个厌氧罐放入温箱培养。2 .真空干燥器法将接种好的平皿或试管放入真空干燥器中，开动抽气机，抽至高度真空后，替代以氢、氮或二氧化碳气体。将整个干燥器放进孵育箱中培养。3 .加热密封法将液体培养基放在阿诺氏锅内加热10min,驱除溶解液体中的空气，取出，迅速置于冷水中冷却。接种厌氧菌后，在培养基液面覆盖一层 0.5cm的无菌凡士林石 蜡。置37c培养2448h
19、后观察。4 .高层琼脂柱法 加热融化一管适合分离厌氧菌用的琼脂培养基，待冷至50 c左右，接入少许经适当稀释的待分离的培养物或含菌材料，充分摇震均匀。在琼脂凝固前，迅速以无菌滴管吸取上述已接种的琼脂培养基，注入准备好的玻璃管内（长约 15 cm, 一端塞小胶 塞或小木塞，另一端塞棉花塞，高压灭菌备用），装至4/5左右之处，塞好棉花塞，放在大试管或玻璃筒内，置 37c恒温箱中培养。长出菌落后，拔去胶塞和棉花塞，以无菌玻棒将 琼脂柱推出于无菌平皿中，再用灭菌接种环钓取独立菌落作厌氧纯培养。三、兼性厌氧菌的分离培养方法（二氧化碳培养法）在细菌培养中，有少数细菌（如牛型布氏杆菌）在含有510%二氧化碳
20、的环境下才能生长。最简单的二氧化碳培养法是烛缸法：将接种细菌的培养基置玻璃干燥器或其他可以密闭的玻璃缸内，在其内点燃一小段蜡烛，加上盖（盖边涂上凡士林以防漏气），约1min左右蜡烛自然熄灭，此时缸内氧气已被消耗，缸内所含二氧化碳约 510%。注意蜡烛勿太长，而且不宜靠近缸壁，以免因局部玻璃过热而破裂。也可用化学物质作用生成二氧化碳气体如 碳酸氢钠与硫酸钠或碳酸氢钠与硫酸。四、细菌的钓菌、纯培养和移植将划线分离培养 37c 24h的平板从温箱中取出，挑取单个菌落，经涂片、染色镜检， 证明不含杂菌，此时用接种环挑取单个菌落，移植于琼脂斜面培养，所得培养物即为纯培养 物，再作其它各项试验检查和致病性
21、试验等。具体操作方法如下：图4-11斜面接种时试管的拿法1 .接种环移植法两试管斜面移植时，左手斜持菌种管和新鲜空白琼脂斜面各一管，使管口互相并齐，稍上斜，管底握于手中，松动两管 棉塞，以便接种时容易拔出（图 4-11）。右手食 指和拇指执接种环，烧灼接种环，以右手小指扭 开一管的棉塞，无名指扭开第二管的棉塞。棉塞 头向掌心内，将试管口通过酒精灯火焰灭菌，待冷却后将接种环插入菌种管中，钓取细菌少许取 出接种环立即接种在新鲜空白琼脂斜面上，不要碰及管壁，直达斜面底部。从斜面底部开始划曲线或直线，向上至斜面顶端为止，管口通过火焰灭菌后，塞好棉塞。接种完毕，将接种环烧37 c温箱中培养。斜灼灭菌后放
22、下接种环。用蜡笔在试管上标明细菌名称和接种日期，置 面接种无菌操作过程如图 4-12所示。2 .吸管或注射器移植法欲移植定量的液体培养物或表面有液体石蜡油的厌氧菌培养物，可以利用吸管或注射器移植，其操作方法是以无菌吸管或无菌注射器吸取培养物，代替接种环进行移植。图4-12斜面接种无菌操作程序本上与纯培养接种相同， 不同的是用接种针挑取菌落，垂直刺入培养基中。的中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。六、细菌培养性状的检查五 、穿刺 培养明 胶穿 刺和 琼脂 柱穿 刺方 法基要从培养基表面（一）细菌在固体培养基上的生长表现1.琼脂平皿上的生长表现细菌于固体培养基表面生长繁殖，形成单个肉眼可见的细
23、菌集落群体，称为菌落。 各种细菌的菌落，按其特征的不同，可以在一定程度上鉴别某种细菌。如葡萄球菌在琼脂平皿上，由于产生色素的不同，形成各种颜色的圆形而突起的菌落； 炭疽杆菌形成扁平干燥，边缘不整齐的火焰状菌落，用放大镜观察时，呈卷发样构造；肠道杆菌属的细菌，形成圆形、湿润、粘稠、扁平、大小不等的菌落；巴氏杆菌和猪丹毒杆菌， 形成细小露珠状菌落。 观察菌落的方法除肉眼外，还可用放大镜，必要时也可用低倍显微镜12341图4-13菌落的形状、边缘和表面构造1 . 圆形、边缘整齐、表面光滑；2.圆形、边缘整齐、表面有同心圆；3.圆形、叶状边缘、表面有放射状皱褶；4.圆形、锯齿状边缘、表面较不光滑；5.
24、不规则形、波浪状边缘、表面有不规则皱纹；6.圆形、边缘残缺不全、表面呈颗粒状；7.毛状；8根状进行检查。观察的主要内容有（图 4-13,图4-14）:图4-14菌落的隆起度1 .扁平状；2.低隆起；3.隆起；4.台状；5.脐状；6.纽扣状；7.乳头状；8.褶皱凸面(1)大小 菌落的大小，规定用毫米( mm)表示，一般不足 lmm者为露滴状菌落；12mm者为小菌落；24mm者为中等大菌落；46mm或更大者称为大菌落或巨大菌落。(2)形状 菌落的外形有圆形、不规则形、根足形、葡萄叶形。(3)边缘菌落边缘有整齐、锯齿状、网状、树叶状、虫蚀状、放射状等。(4)表面性状观察其是否平滑、粗糙、皱裘状、旋涡
25、状、荷包蛋状，甚至有子菌落等。(5)隆起度 表面有隆起、轻度隆起、中央隆起，也有陷凹或堤状者。(6)颜色及透明度菌落有无色、灰白色，有的能产生各种色素；菌落是否有光泽，其透明度可分为透明、半透明及不透明。(7)硬度 黏液状、膜状、干燥或湿润等。(8)溶血情况 若是鲜血琼脂平皿，应看其是否溶血、溶血情况怎样。2 .琼脂斜面上生长表现(图 4-15) 将各种细菌分别以接种针直线接种于琼脂斜面上(自底部向上划一直线)，培养后观察其生长表现。3 .琼脂柱穿刺培养中的生长表现将各种细菌分别以接种针穿刺接种于琼脂柱中，培图4-16琼脂料窗剌墙舞蒯倍落胸圜落表现1,缰弑；22 .棘槛；33 .啾味；4 .扩
26、散状；5.根状4.绒毛状；5.根状12345养后观察其生长表现，如图 4-16所示。取大肠杆菌、枯草杆菌和其他细 菌分别以接种针穿刺接种于明胶柱，置22c温箱中培养后观察其液化与否和液化的情况，不同细菌对明胶柱的液化作用各不相 同，其形式如图4-17所示。(三)细菌在液体培养基中的生长表现(如图 4-18所示)将马腺疫链球菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌、炭疽杆菌等分别接种于肉汤中，培养后观察其生长情况，主要观察其混浊度、沉淀物、菌膜、菌环和颜色等。1 .混浊度细菌接种在液体培养基中经适当培养后其表现性状不同，有均匀混浊，轻度混浊或培养基保持透明(表面有菌膜或底部有沉淀物)。2 .沉淀物 细菌在液体培养基中所形成的沉淀有：颗粒状沉淀、粘稠沉淀、絮状沉淀、 小块状沉淀。另外还有不生成沉淀的细菌。3 .表面性状主要是细菌在液体培养基中培养后，有无菌膜或菌环形成等。，色素能溶于水，所以细菌在液体培养4 .颜色有的细菌在生长繁殖过程中能产生色素 基中培养后，所产生的色素会使培养基的颜色发生变化。B 4-18细南确膜H弁询塔素理长表现1：物鼠见桃山西偎膜港.；芜鲁剧匀状4.漏斗状；5.囊状；6.层状