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1、肠杆菌科【器材】一、 SS 平板培养基：选择性培养基，有促进目的菌生长的物质和鉴别用指示剂.1、煌绿、胆盐、硫代硫酸钠、枸橼酸钠等能抑制2、大肠分解乳糖产酸：中性红（6.8 红 8.0G+ 菌及大多数大肠生长，胆盐促进伤寒生长。黄）变红，与胆盐结合合成胆酸，因而形成中心混浊的深红色菌落，病原菌不分解乳糖，故菌落呈透明微黄色。3、枸橼酸铁能指示硫化氢产生，硫化铁呈黑色4、硫代硫酸钠有缓和胆盐对志贺、沙门菌的毒害作用，并中和煌绿、中性红染料的毒性，使大肠红色鲜明二、 KIA 斜面培养基： 用酚红作指示剂（ 6.8 黄 8.4 红）。上层为固体琼脂斜面，含乳糖。下层为半固体琼脂，含葡萄糖，含硫酸亚铁
2、。1、细菌如能发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，则斜面及底层均呈黄色，且有气泡。非致病菌（如大肠埃希菌）一般既可利用乳糖也可利用葡萄糖，但肺克也是如此。2、如细菌只发酵葡萄糖不发酵乳糖，因 葡 :乳为 1:10，斜面所产生的少量的酸可因接触空气而氧化挥发，从而使斜面部分保持原来的红色；底层则是在相对缺氧的状态下，所生成的酸不被氧化挥发而保持黄色。致病菌一般不能利用乳糖，可用于区别致病/非致病菌。3、如细菌分解蛋白质产生硫化氢，则与硫酸亚铁反应生成硫化亚铁（黑色沉淀物），使培养基变黑。左：不发酵乳糖，强产硫化氢。中：不发酵乳糖，不产硫化氢。右：发酵乳糖，不产硫化氢4、接种方法：先穿刺到底，再在斜面划线。
3、【实验内容】一、氧化酶试验原理：见奈瑟菌属部分操作：取氧化酶纸片，刮去KIA或普通平板或普通平板上的较大菌落，观察纸片颜色的变化，呈蓝紫色为阳性， 不变为阴性 （如试剂为盐酸二甲基对苯二胺，阳性者则为红色） 。肠杆菌科多为阳性（但变形杆菌为阴性） 。注意事项：因SS 培养基中的化学成分和生化反应复杂，其菌落可使滤纸变为紫红色，故对肠道杆菌进行触酶和氧化酶试验时，宜从普通平板或KIA 斜面上取菌，以保证试验结果正确。二、动力试验：原理：有动力的细菌在半固体培养基中沿穿刺线扩散生长。培养基：半固体培养基方法：分别穿刺接种大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，37 孵育 16-18h结果：穿刺线扩散，培养基透明
4、度减低为动力阳性；穿刺线清晰，培养基透明为动力阴性。本试验，大肠为（ +），肺杆为（ -）三、吲哚试验： （靛基质试验）原理：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，与对二甲基氨基苯甲醛形成红色化合物。培养基：蛋白胨水方法：将大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种于蛋白胨水培养基中，37 孵育 16-18h结果：取出后，滴加吲哚试剂2d，混匀，可见培养物上层呈玫瑰红色为+，不变色为 -。本试验，大肠为（ +），伤寒为（ -）四、尿素酶试验：原理：产生尿素酶的细菌能分解尿素，形成氨，使培养基呈碱性，酚红指示剂变成红色。培养基：尿素培养基方法：将大肠埃希菌和变形杆菌分别接种于尿素培养基中，3
5、7孵育 16-18h结果：培养基变红色者为阳性。变黄为阴性。本试验，大肠为（-），变形为（ +）五、甲基红试验：原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解为甲酸、乙酸等，故培养物pH 在 4.5以下，加入甲基红指示剂后呈红色。有些细菌分解葡萄糖产生的酸进一步转化为其它物质，如醇、酮等，培养基 pH 在 6.2 以上，加入甲基红指示剂呈黄色。培养基：葡萄糖蛋白胨水方法：分别接种大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌结果：加入甲基红指示剂2d，混匀，红色为阳性，黄色为阴性。本试验，大肠为（+），肺杆为（ -）六、苯丙氨酸脱氨酶试验：原理：某些细菌（如变形杆菌属），可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱氨
6、生成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂与苯丙酮酸螯合后形成绿色化合物。培养基：苯丙氨酸琼脂培养基方法：分别接种大肠埃希菌和变形杆菌，37孵育 16-18h结果：滴加 100 g/L 三氯化铁试剂，出现绿色为+，不变为 -。本试验，变形为（ +），大肠为（ -）七、柠檬酸盐利用试验：原理：当细菌可以利用铵盐作为唯一的氮源，同时利用柠檬酸钠作为唯一碳源时，可在柠檬盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐为碳酸盐，使培养基变碱，指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色，为柠檬酸盐利用试验阳性。若不能利用则不能生长，培养基不变色，为阴性。培养基：西蒙柠檬酸盐培养基方法：分别接种大肠埃希菌和变形杆菌， 37 孵育 16-18h
7、 结果：大肠 -（绿色），变形 +（蓝色）八、总结：结果判断与观察KIA ：观察上部和下部的颜色变化，变黄为产酸，变红为产碱，有气泡为产气，有黑色为产硫化氢。动力（ M ）：半固体上沿穿刺线生长，周围清澈，为阴性，周围混浊者为阳性。吲哚（ I）：在蛋白胨水中滴加靛基质试剂2-3 滴，立刻变红者为阳性，不变为阴性。尿素酶试验（ U ）：变为深粉红者为阳性，不变或变黄者为阴性。甲基红试验（ Mr ）：在葡胨水中滴加甲基红试剂2-3 滴，变红为阳性，变黄为阴性。枸橼酸盐利用试验（C）：细菌在上生长，颜色变为蓝色为阳性，细菌不长或培养基颜色不变为阴性。苯丙氨酸酶试验：在斜面上滴加试剂滴，变成暗绿色为阳
8、性，不变为阴性。KIAMIU苯菌种甲基红枸橼酸丙斜面底层产气硫化氢动力吲哚脲酶（Mr ）盐（ C）氨酸大肠埃希菌AA+-+-+-福氏志贺菌KA-/+-+/-+/-宋内氏志贺菌KA-/+-+-+/-伤寒沙门氏菌KA-+/-+-+/-甲型副伤寒菌KA+-/+-+-乙型副伤寒菌KA+-+-肺炎克雷伯菌AA+-+-+-变形杆菌KA+/-+【其他试验】一、大肠埃希菌1、形态结构观察：革兰阴性、中等大小、两端钝圆、多呈单个散在分布的杆菌。鞭毛染色为周毛菌2、菌落观察：在普通琼脂平板上呈圆形、灰白色、湿润、光滑型菌落；在血琼脂平板上呈圆形、灰白色、湿润、光滑型菌落，某些菌株有溶血；在菌落，多数为光滑型菌落。
9、二、志贺菌属SS 琼脂平板上呈红色、圆形、凸起、边缘整齐的1、形态结构观察：为格兰阴性杆菌，散在分布，多无鞭毛2、菌落观察：在SS 和 MAC 平板上形成无色透明、中等大小的菌落，除宋内氏志贺菌外，菌落均为光滑型。3、血清学试验：凡生化反应符合志贺菌属者均需做血清学鉴定。方法：取一环志贺菌四种多价血清与载玻片一端，再取少许待测菌与之混合，同时在玻片另一端取待测菌与之混合，同时在另一端取待测菌与生理盐水混合对照。结果判定：对照呈均匀浑浊，待检菌与志贺菌四种多价血清混合后，数分钟内出现肉眼可见的颗粒状凝集物即为阳性。继之用 A/B/C/D 群最常见的单价血清凝集定种。报告：分离培养未见可疑菌落或经
10、鉴定不符合志贺菌属鉴定依据者可报告“未分离到志贺菌属细菌”。经分离鉴定后符合鉴定依据者，可报告“分离出 XX 志贺菌”，若进一步做多种生化反应及因子血清分型后，可报告“分离出 XX 志贺菌 X 型”。二、伤寒沙门菌属1、形态结构观察：沙门菌属为革兰阴性细长杆菌，鞭毛染色可见周鞭毛。2、菌落观察：在 SS 和 MAC 平板上形成无色、半透明、光滑湿润、凸起的小菌落，产硫化氢的菌种可在 SS 平板上形成中心带黑褐色的小菌落。3、血清学试验：若生化反应及形态学检查疑为沙门菌，可选用沙门菌的多价诊断血清进行玻片凝集试验 .方法：首先选用AF 组多价“ O”诊断血清做玻片凝集试验。在试验时以生理盐水作对
11、照。本试验在 510 min 内不出现凝集者可确定为阴性。但若生化反应比较典型，应考虑选用Vi 凝集试验，若凝集，则用无菌生理盐水将菌洗下，制成浓厚的悬液，100加热30min ，再与AF 组多价“ O”诊断血清做玻片凝集试验。若与AF 组多价“ O”血清发生凝集，应再与沙门菌单价因子血清分别做玻片凝集试验，以确定该菌株属于哪一组。一般先选用本地区检出率最高的菌型的相应血清做玻片凝集。若已确定哪一沙门菌种后，再分别先用H 因子血清检查第I 相抗原，然后检查第II相抗原，最后确定该菌种属于哪一型沙门菌。群ABCDE菌体抗原 (O)24793鞭毛抗原（ H ）abcde菌种甲型副伤寒乙型副伤寒丙型
12、副伤寒伤寒沙门菌鸭沙门菌（ PA）（ PB）（ PC）报告：分离培养未见可疑菌落或经鉴定不符合沙门菌属细菌者，可报告“未分离出沙门菌”。生化反应符合沙门菌，玻片凝集试验阳性者，可初步报告为“分离到 XX 沙门菌”或“ X 群沙门菌”。三、肺炎克雷伯菌1、形态结构观察：为无芽孢格兰阴性杆菌，呈卵圆形或球杆状，常呈双排列，无鞭毛。2、菌落观察：在血琼脂平板上形成圆形、凸起、灰白色、不溶血、光亮的大菌落，相邻菌落易于融合，黏液状，若用接种针蘸取呈长丝状拽起。在 MAC 平板上呈乳糖发酵产酸的菌落，即红色、较大、浑浊、凸起的粘液型菌落，较大肠埃希菌大。与大肠埃希菌鉴别IMViC大肠埃希菌+-肺炎克雷伯菌-+四、变形杆菌1、形态结构观察：为革兰阴性杆菌，两端钝圆，有明显多形性，在一定条件下可形成球杆状或丝状；无芽孢和荚膜，鞭毛染色为周鞭毛。2、菌落观察：在营养琼脂平板上呈波纹状迁徙生长现象；在SS 琼脂平板上呈无色、圆形、中等大小的乳糖不发酵型菌落，中心通常为灰褐色。肠杆菌鉴定程序粪便标本其他标本接种选择性培养基（SS，麦康凯，伊红美蓝）接种血平板,GS35 24 小时挑取可疑菌落（SS 上非红色菌）GS,氧化酶，（药敏）G 杆菌或弧菌氧化酶（ +）G-杆菌或球杆菌形态氧化酶（-）杆菌杆菌或弧菌（ KIA，MIU， IMViC，苯丙氨酸）非发酵菌科弧菌科肠杆菌科初步鉴定，作血清凝集最终结果