《应用RNAi抑制食管癌细胞端粒酶活性的实验研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《应用RNAi抑制食管癌细胞端粒酶活性的实验研究.docx（9页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、应用RNAi抑制食管癌细胞端粒酶活性的实验研究彭彦辉王亮陈卫云郝玉宾邢邯英【摘要】目的研究载体介导RXA干扰技术(RXAi)对人食管癌细胞株ECA109端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)表达及端粒酶活性的抑制作用。方式设计并构建3条hTERT基因的siRNA序列干扰质粒I、II、HI及对照质粒，并将其别离转染ECA109食管癌细胞,应用RTPCR法观看各转染细胞hTERTmRNA表达水平的改变，结尾重复片段扩增酶联免疫吸附(TRAPELISA)方式测定细胞端粒酶活性。结果与对照质粒比较，转染24h后，干扰质粒I、II、III组细
2、胞端粒酶活性均显著下降(P<转染48h后，各干扰质粒的抑制率依次为4996、79%、53%。干扰质粒转染ECA109细胞中hTERTmRNA的表达较对照质粒转染ECA109细胞中hTERTmRNA的表达量显著下降，仅为对照组的。结论成功构建载体介导的hTERT靶向RXA干扰重组体,能有效抑制ECA109细胞端粒酶活性及hTERTmRNA的表达。【关键词】RXA干扰;食管癌;人端粒酶逆转录酶;端粒酶AbstractObjectiveToinvestigatetheeffectofRXAinterference(RXAi)ontheexpressionofhumantelomeraserev
3、ersetranscriptase(hTERT)andtheactivityoftelomerase.MethodsAccordingtothenucleotidesequenceofhTERTingenebankandreferringtothedesignstrategiesofsiRNA,mRNAinterferingdoublestrandedDNAvectorI,II,IIIandthecontrolvectorwereconstructedrespectivelyandthenweretransfectedintotheECA109cells.TheexpressionsofhTE
4、RTofthetransfectedcellsweredeterminedbyRTPCRandtheactivityoftelomerasewasdeterminedbytelomericrepeatamplificationELISA(TRAPELISA).ResultsComparedwiththecontrolvectorgroup,thetelomeraseactivationofECA109cellsininterferingvectorI,H,IIIgroupwereloweraftertransfectedfor24and48h(P<.TRAPELISAresultssho
5、wedthattheinhibitionrateofinterferingvector【，II,IIIonthetelomeraseactivationwere49%,79%,53%respectivelyandthemaximuminhibitionratewasinterferingvectorII.InterferingvectorIIalsodeclinedthemRNAexpressionlevelofhTERTgeneinECA109cellsascomparedwiththecontrolgroup.ConclusionsThesiRXAexpressionplasmidwass
6、uccessfullyconstructedandcouldinhibittheexpressionofhTERTmRNAandtelomeraseactivity,whichmaybebeneficialinsearchingfornewgenetherapyofthetumors.KeywordsRXAinterference;Esophagealcarcinoma;Humantelomerasereversetranscriptase;Telomerase最近几年研究证明肿瘤组织中端粒酶阳性率高达85%以上，人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscrip
7、tase,hTERT)是端粒酶活化和细胞癌变的限速步骤(1)。抑制其表达可有效地抑制肿瘤细胞的生长和诱导凋亡，目前己成为肿瘤基因医治的理想靶标。RNA干扰(RNAi)作为一种简单有效的代替基因敲除的工具正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命。本研究拟选择hTERT基因作为研究靶点，运用体外转录法合成多对小干扰RXA(siRXA),转染人食管癌细胞，检测其对端粒酶活性的抑制，挑选出高效抑制端粒酶活性的siRNA,为开发抗肿瘤新药和基因医治提供实验和理论依据。1材料与方式材料人食管癌细胞株ECA109购自北京大学医学部肿瘤研究所;端粒酶试剂盒购自Roche公司；质粒纯化试剂盒购自Qiagen公司;
8、LipofectamineTM2000为Invitrogen产品；KCsiRNATM试剂盒购自上海康成生物工程公司。方式细胞培育ECA109细胞用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培育基置于5%C02,37的饱和湿度培育箱中培育，每3天传代一次。载体构建质粒图谱见图lo依照基因文库中报导的hTERT的核甘酸序列(序列号：BC062321),参考siRNA的设计谋略，通过基因blast,挑选3条款的hTERT基因的siRNA序列：I(563581)：TTGCAAAGCATTGGAATCA;II(740-757)：AGAACGTTCCGCAGAGAA;III(16571676)：GTACAGGTT
9、TCACGCATGTo关于每一个选定的siRNA序列，设计合成两条siRXA的DXA模板单链。模板链包括siRXA的正义链与反义链，中间以9个脱氧核苜酸“形成的环”结构相连，后面接有RNAPolylH聚合酶转录终止位点，同时模板两头别离设计BamHl和HindIII的酶切位点。DNA模板单链经退火形成双链，siRXA空载体用BamHl和HindIII双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳，回收线性载体;采纳T4连接酶，把siRNA插入片段连接到线性载体中；连接产物转化DH5a大肠杆菌，挑取56个细菌克隆抽质粒、扩增，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定具有siRNA插入片段的阳性克隆。图1质粒pRNATNeo(638
10、0bp)图谱酶切鉴定单酶切：将对照质粒和重组质粒H、HI用HindIII单酶切，酶切产物1%脂糖凝胶电泳;双酶切：将对照质粒和重组质粒I、II、III用BamHI和HindIII双酶切,酶切产物以1%琼脂糖凝胶电泳。转染ECA109细胞转染前24h接种4X105个细胞于无抗生素含血清DMEM培育液中（12孔板）,使其在转染时可长至90%95%融合。将DNALipofectamine转染复合物加入无血清细胞培液中，46h改换培育液。转染后24、48h,检测目的基因的敲除成效和端粒酶活性的转变。端粒酶活性检测按TRAPELISA检测试剂盒说明书操作。转染细胞端粒酶逆转录酶mRNA表达水平检测Tri
11、zol一步法提取细胞总RNA。取逆转录反映液，别离进行hTERT和内参照3actin基因的PCR扩增。HTERT上下游引物别离为：5,CGTTCTGGCTCCCACGAC3,5AGTGTCTGGAGCAAGTTGCA.4A3,扩增产物全长198bp,PCR具体循环参数为:9510min;9230s,601min,701min共40个循环。Bactin扩增产物全长621bPo扩增产物进行琼脂糖电泳，UVP凝胶显像仪扫描并进行图像分析。统计学处置采纳统计软件处置，实验数据以x土s表示，两组间比较采纳t查验，多组间比较采纳单因素方差分析。重组质粒和对照质粒酶切鉴定经BamHl和HindHI双酶切后干
12、扰质粒插入片段为110bp左右，对照质粒插入片段为70bp左右（图2）。M:Marker;13：干扰质粒I、II、IH;4:对照质粒图2重组质粒双酶切鉴定转染细胞绿色荧光表达细胞转染质粒48h后，应用荧光显微镜观看各转染组均见有表达绿色荧光的细胞，占细胞总数的50%60%（图3）。1：干扰质粒I;2：干扰质粒H;3：干扰质粒HI;4:对照质粒图3各转染组绿色荧光蛋白表达（转染48h,X100）端粒酶活性测定与对照质粒比较，转染24h后，干扰质粒I、II、in组细胞端粒酶活性均显著下降其中转染质粒n组细胞下降最为显著，与干扰质粒I、hi相较不同也有显著性（p&it；转染48h后，依照公式：抑制率
13、=（对照组平均酶活性-干扰组平均酶活性）/对照组平均酶活性X100%,各干扰质粒的抑制率依次为49%、79%、53%,干扰质粒II对端粒酶活性的抑制作用最为显著（表1）。表1各转染组端粒酶活性与对照质粒比较：i）p&it；与干扰质粒n比较：2）p&it；转染细胞端粒酶逆转录酶mRNA表达水平与对照质粒转染细胞相较较，干扰质粒H转染细胞中hTERTmRNA的表达量显著下降,hTERT扩增产物与内参照Pactin的IOD值比较在对照质粒和干扰质粒H组别离为35,722,不同显著（P<,干扰质粒hTERTmRNA的表达量降低（图4）o3讨论由于hTERT在80%90%的肿瘤细胞中表达，且和端粒
14、酶活性有高度相关性，是端粒酶活性的限速因子（2）。因此，人们把抑制端粒酶活性的重点集中在hTERT和人端粒酶RNA（hTR）oRNAi通过内源性表达或外源性介导siRXA以序列特异性的方式有效抑制内源性基因的表达。本实验将转录siRNA具有反向重复序列的DNA模板,克隆到RXA聚合酶（PolIH）转录单位中，以质粒DNA为载体转染人食管癌细胞系ECA109,利用细胞中RNA聚合酶持续转录合成RNA,这种RNA内部互补折叠形成发夹样结构，在细胞内酶的作用下迅速形成siRNA,可在更长的时刻内抑制基因的表达（3）。将编码针对hTERTsiRNA模板，定向克隆到POLIII启动子U6启动子的下游，由
15、于U6启动子几乎所有元件均位于转录起始区的上游，因此几乎任何小于400bp的插入序列都能被有效转录，在遇见45个持续的T时会终止转录，形成内源性表达的RNA,其正义链(19nt)的3,端与反义链(19nt)的5，端由9bp的loop环连接，互补折叠形成发夹样结构,此种结构的RXA与体外合成的siRNA一样，能有效地诱导靶基因的RNAi(4)。在构建载体时，设计了GFP编码基因和新霉素抗性基因(Ne。)，前者编码绿色荧光蛋白，便于观看载体转染细胞的效率，优化转染条件，后者使转染后细胞能够在G418压力下挑选取得稳固表达细胞,能够进行长期基因沉默的研究。参照靶向mRNA或cDXA序列设计siRXA
16、是RNA干扰实验的关键。本实验从基因文库中获取hTERTcDNA序列，经blast比对设计hTERTmRA特异3对shRXA和阴性对照，别离转染ECA109细胞，检测端粒酶活性，挑选出高效抑制肿瘤端粒酶活性的shRNA作为进一步研究对象，本实验三个干扰质粒对端粒酶活性的抑制率为49%、79%.53%,最高抑制率为79%,与文献报导60%80%的抑制率相似，RTPCR示siRNA对hTERTmRXA表达的抑制率为。端粒酶活性与hTERTmRXA水平紧密相关，是调剂端粒酶活性的限速步骤，在细胞增殖及永生化进程中发挥重要作用。而特异性抑制hTERT的表达可降低端粒酶的活性，抑制肿瘤细胞的生长和诱导细
17、胞凋亡。本实验采纳以质粒为载体构建重组体的方式，该方式的优势是使siRXA直接在体内取得稳固表达,是用于RNAi长期研究的较好方式。目前基因转染有磷酸钙沉淀法，电穿孔法，机械法等，本研究选择了Invitrogen公司的LipofectamineTM2000转染试剂，该试剂的优势是：转染效率高，细胞损伤小，可在含血清的培育基中进行转染，而且从转接细胞到结果检测进程不需要换液，按说明书方式进行操作转染取得成功。综上所述，本研究成功构建载体介导的hTERT靶向RNA干扰重组体，能有效抑制ECA109细胞端粒酶活性及hTERTmRXA表达，确信特异抑制端粒酶活性的siRNA靶点，为进一步开发抗肿瘤新药
18、和基因医治提供实验和理论依据。【参考文献】1 ChangJT,ChenYL,YangHT,etregulationoftelomeraseactivitybysixtelomerasesubunits(J).EurJBiochem,2002;269(14)：344250.2 NakamuraTM,MorinGB,ChapmanKB,etcatalyticsubunithomologsformfissionyeastandhuman(J).Science,1997;277(5328):9559.3ShiRNAiforthemasses(J).TrendsGenet,2003;19(1)：912.4PaulCP,GoodPD,WinerI,etexpressionofsmallinterferingRNAinhumancellsJ).NatBiotechnol,2002;20(5)：5057.