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1、动物细胞培养生产生物制品的澄清工艺溶瘤病毒，单抗，疫苗，部分重组蛋白生物类似药，基因工程亚单位疫苗 等生物制品工业生产都是始于动物(或昆虫)细胞的培养，通过细胞培养的方 式扩增基因序列或者表达蛋白。细胞培养制备生物制品或生物药已成为当代生 物制品及生物药工业化生产最主要的方式之一。溶瘤病毒的工业化生产，通常都是将含有目的基因序列的基因重组到病毒 载体上，在将病毒转入动物细胞内，通过细胞培养的方式进行生产，扩增后的 细胞进行破碎等后续的纯化制备而成；治疗性单抗 ，部分重组蛋白生物类似药及 基因工程亚单位疫苗的生产，是把表达蛋白的基因重组到质粒上，然后在将质 粒转入CHO细胞内，通过扩培CHO细胞
2、，表达单抗；病毒类疫苗是扩增细胞 后，接种病毒的方式生产。治疗性单抗下游工艺过程1.细胞培养物对下游纯化工艺的影响(1)培养物中的核酸增加了料液的黏度，不但造成核酸、蛋白、细胞碎片等物质混悬难以通过离心一次性分离，而且对于采用层析的捕获方式，也造成 层析填料的大面积板结难以特异性吸附目的蛋白，部分颗粒物质进入填料 孔内，造成填料孔堵塞，降低了填料的使用寿命；(2)颗粒物质进入层析柱柱床中填料间隙，导致层析柱使用时的反压升高，从 而导致流速降低，影响整个工艺过程的效率；(3)颗粒物质增加了填料进口堵塞和层析系统压力持续上升的风险性而造成料 液难以透过，并且影响层析柱筛网的使用寿命；(4)颗粒物质
3、和目标蛋白之间的非特异性作用力，影响目标蛋白的回收率。2 .细胞培养物澄清工艺的重要性(1)通过澄清降低料液的黏度并完成固液分离，所得的裂解上精液就可以顺利 流过层析系统以实现目的蛋白与填料的特异性吸附；(2)澄清能更好的维护下游捕获及纯化时层析过程的可操作性，处理量及收率； (3)澄清最大限度的减少了样品对层析填料品质的影响，提高填料的使用寿命，降低工艺成本；(4)澄清处理也可以去除部分可溶性的杂质进而实现料液的粗纯，提高捕获及 精纯时层析填料的载量，降低样品对层析填料污染的风险性；(5)澄清处理降低了料液的粘度，提高了捕获及精纯时层析过程的流速，提高 了工作效率，降低工艺成本；(6)澄清处
4、理降低了层析柱筛网的堵塞风险，提高层析柱筛网的使用寿命；(7)澄清处理降低了后续料液换液及浓缩时膜包的污染风险，提高了后续换液 及浓缩设备的使用寿命。3 .细胞培养物澄清工艺下游工艺中细胞培养物通常通过离心去除大量的细胞等固形物，离心后还 需要通过各种膜组件进行澄清。除了离心进行固液分离，膜过滤技术是另一种 几乎不改变料液性质而实现固液分离的分离技术。膜过滤技术用于细胞培养物 澄清有死端过滤向和切向流两种方式。死端过滤是压力推动料液流动直接垂直于膜表面而穿过滤膜。这种操作过 程相对简单，但处理悬浮物含固量较高的料液则面临易堵塞、压力大以及膜面 积大等问题，因为细胞碎片和核酸等悬浮物会快速在膜上
5、形成聚集并快速加厚 而阻碍液体通过。切向流过滤是料液流动平行于膜表面推动部分料液穿过滤膜，而截流料液 沿膜上流过。切向流过滤的操作过程相对复杂，压力的走向分为两个动力，一 个垂直于膜表面类似于常规死端过滤起到过滤的作用，另一个平行于膜表面用 截流的料液冲刷膜表面的作用,这种作用减缓了膜表面富集悬浮物造成膜堵塞 进而显著提高处理效率及单位膜面积处理量，因此切向流过滤用于澄清工艺有 显著优势。(A) ProssurQ(B) ShakingSom-c rmnd falls thraugh匚ffaortiwt! oize oeparatfonuntil tho scnocn clo-gs = Sand
6、O - pnnips4 .微滤膜包在细胞培养物澄清工艺中的应用表达体系:CHO细胞过滤细胞、细胞碎片.多聚体、DNA, HCP等过滤前浊发1667NTU过滤后浊度3.5NTU澄清方式:0.22um膜包r膜结构良用途过滤方 式目标蛋白分 f,量面超及膜孔棒处理体 积处理时间激滤膜包 /澄清过滤TFF150kdO.Illi2, 0r22umG0L1WJO22M20LIDmin样品；昆虫细胞-杆状病毒用养物注前浊度820NTU滤脑浊度2 1NTU过滤疗式：0.2如m股包切向流过沔锹结构*用途过六方 式H标蛋白分子量而枳发.膜孔笆处理体枳处理时间一痴融膜包TFF54kdO.LLU2. 0.22114) 0O1IOOO22M3L81nll1上面两张图片均为大肠杆菌表达胞内可溶蛋白时收集的菌体裂解液，用 0.45um孔径的膜包澄清处理效果及结果展示。5 .澄清工艺总结及展望细胞培养物制备生物制品下游工艺过程中，收货及澄清工艺中，在除细胞 碎片等悬浮物的过程中，也可通过添加絮凝剂（如氯化钙，聚二烯丙基二甲基 氯化氨，聚烯丙胺等）提高离心时去除固形物的效率及效果。通常都是先离心 在微滤的方式去固形物达到澄清的目的。