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1、实用标准文案免疫细胞研究western blotWestern Blot常见问题及处理总结 阿木1、western blot 的优点答：灵敏,可达ng级,用Ecl显色法理 论上可达pg级.方便,特异性高.2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋 白？答：原因有很多：a你的细胞中不表达这 种蛋白质,换一种细胞；b你的细胞中的 蛋白质被降解掉了,你必需参加 PMSF, 抑制蛋白酶活性；c你的抗体不能识别目 标蛋白,多看看说明,看是否有问题.3、我的细胞提取液有的有沉淀,有的很 清亮,为什么呢？文档大全实用标准文案答：a有沉淀可能由于你的蛋白没有变 性完全,可以适当提升SDS浓度,同时 将样品煮沸时间延
2、长,b也不排除你的抗原浓度过高,这时再参加适量上样缓冲 液即可.4、我做的蛋白质分子量很小10KD,请问怎么做WB?答：可以选择0.2 m的膜,同时缩短转移 时间.也可以将两张膜叠在一起,再转移c 其他按步骤即可.5、我的目的带很弱,怎么增强？答：可以加大抗原上样量.这是最主要的. 同时也可以将一抗稀释比例降低.6、胶片背景很脏,有什么解决方法？答：减少抗原上样量,降低一抗浓度,改文档大全实用标准文案变一抗孵育时间,提升牛奶浓度.7、目标带是空白,周围有背景,是为什 么？答：你的一抗浓度较高,二抗上 HRP催 化活力太强,同时你的显色底物处于一个 临界点,反响时间不长,将周围底物催化 完,形成
3、了空白即反亮现象.将一抗和二抗浓度降低,或更换新底物.8、我的胶片是一片空白,是怎么回事？答：如果能够排除下面的几个问题那么问 题多半出现在一抗和抗原制备上.a)二抗的HRP活性太强,将底物消耗 光；b) ECM底物中H2O2,不稳定,失 活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d)二抗失活.文档大全实用标准文案9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢？答：a可能是红灯造成的,胶片本来就被 曝光了,可以在完全黑暗的情况下操作. 看是否有改善.；b显影时间过长.10、DAB好还是ECM 好?答：DAB有毒,但是比拟灵敏,是HRP最 敏感的底物；ECM结果容易限制,但被 催化
4、时灵敏度差一点,但如果到达阀值, 就特别灵敏,可以检测pg级抗原.要看 你实验的情况.11、抗原检测出的分子量比资料上的大, 是怎么回事？答：a抗原形成了二聚体.增多疏基乙醇 量,煮沸变性时间延长,可以翻开二聚体 b蛋白本身的修饰如：糖基化,磷酸化等文档大全实用标准文案12、蛋白转移不到膜上,但胶上有,同时Marker转上去了,为什么？答：可能是：a样品浓度过低；b转移时 间不够,.13、磷酸化抗体的检测样本制备时是否一 定要加NaF等？答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂, 一般最好加.但是不加也可以,大局部时 候是不用加的.14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存 在,需要做免疫组化和west
5、ern blot试验 吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？答： 免疫组化可以用来进行定位,但 是不能精确定量,而且有时会有假阳性,文档大全实用标准文案不易与背景区分；Western blot可以特异 性检测某个蛋白质分子,进行定量,但是 不能定位.两种实验的一抗有时候不能通用,公 司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验,在免疫组化时,是否适合石蜡切 片或者冰冻切片.15、做 Western Blot时,提取蛋白后冻存未加蛋白酶抑制剂,用的博士德的一 抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上 样量已加到120! g换了个santa cloz的 一抗仍不行.是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF
6、行吗？答：疑心是样品问题,可能是：1,样品 不能反复冻融；2,样品未加蛋白酶抑制 剂.同时,建议检查 Western Blot过程,提升一抗浓度.对于加蛋白酶抑制剂来 说,一般加PMSF就可以了,最好能多加文档大全实用标准文案几中种蛋白酶抑制剂.16、细胞水平要做 western blot多少细 胞提的蛋白够做 western blot?答：一般5 M0A6就足够了17、同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western blot有无影响？答：能,没有问题.18、同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot 检测吗？答：当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品.19、如果目标蛋白
7、是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么？文档大全实用标准文案答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去 垢剂要温和得多,这时最好加上NaF去抑 制磷酸化酶的活性.20、我的样品的蛋白含量很低,每微升不 到1微克,但是在转膜时经常会发现只有 一局部蛋白转到了膜上,就是在转膜后染 胶发现有的孔所有的蛋白条带都在,只是颜色变淡了,有什么方法可以解决？答：你可以加大上样量,没有问题,还有 转移时你可以用减少电流延长时间,加20%甲醇.21、想别离的蛋白是分子量 200kd的,SDS-PAGE电泳的别离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大 分子量的蛋白容易作 Western Blot吗？答：200k
8、d的蛋白不好做,别离胶用7%, 积层胶3.5%.文档大全实用标准文案22、如果上样量超载,要用什么方法来增 加上样量？答：可以浓缩样品,也可以根据你的目标 分子量透析掉一局部小分子蛋白.一般地,超载30%是不会有问题的.如果已经 超了不少了,而且小分子量的也要,可以 考虑加大胶的厚度,可以试试 1.5mm的.23、蛋白变性后可以存放多久？答：80C, 一两年没有问题.最关键两 条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消 化掉也是被酶水解了.24、我所测定的蛋白分子量是105KD,按 理说别离胶应当采用7.5%,但资料却要 求别离胶和浓缩胶均采用11%的配方,不 知为何？文档大全实用标准文案答：上述提
9、到的两种凝胶均可以使用,因 为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内,但需注意条带位置.25、二抗是生物素化的抗体,三抗是亲和 素生物素体系,不知采用这样的方案后,封闭液是否要作调整,能否再用 5%的脱 脂奶粉呢？好似有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成,是吗？解答：不能使用脱脂奶粉,由于脱脂奶粉 中含生物素,用B S A代替应该好一点.26、问一般一次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有关系吗？答：Western Blot一般上样 30100 微克 不等,结果跟目的蛋白的丰度、上样量、 一二抗的量和孵育时间都有关系,也与显 色时间长短有关.开始摸条件时,为了拿 到阳性结果,各
10、个步骤都可以量多一点时文档大全实用标准文案间长一点,当然背景也就出来了.要拿到 好的结果,如果抗体好的话比拟容易,抗 体不好的话就需要反复地试了,当然有的 不适合Western Blot的怎样做也不行.27、做组织样品的western的时候,怎样 处理样品？答：必须进行研磨、匀浆、超声处理,蛋 白质溶解度会更好,离心要充分,膜蛋白 需用更剧 烈的方法抽提,低丰度膜蛋白 可能还要分步抽提超速离心.还有一点 就是组织中的蛋白酶活性更强,需要注意 抑制蛋白酶的活性参加P M S F.28、问大分子量蛋白200KD ,在做western 要注意什么呢？答：做200kd蛋白的 Western Blot时
11、要注意,别离胶最好选择7%的；剥胶时要小 心；转移时间需要相应延长；要做分子量文档大全实用标准文案参照否那么出现杂带不知道如何分析.29、有什么方法可以提升上样量？答：a可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量；b用5倍的上样缓冲液来稀释变性30、蛋白的上样量有没有什么具体的要求？答：上样量要根据实验的要求来定, 如果要求是定量和半定量的 Western Blot那么上样量要均等,如果只是要定性,那么没有太大的关系,尽量多上就行了, 但是不要超载.31、一抗,二抗的比例是否重要？答：比拟重要,调整好一抗,二抗的比例, 可以去掉局部非特异的本底.文档大全实用标准文案32、要做磷酸化某因子 West
12、ern Blot,其 二抗有何要求？答：对二抗无要求,要看你实验条件来选 择,一般推荐用HRP标记的二抗.33、免疫组化和Western Blot可以用同一 种抗体吗？答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处 理的抗原决定簇又称表位,有些表位 是线性的,而有的属于构象型；线性表位 不受蛋白变性的影响,天然蛋白和煮后的 蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间 结构限制,煮后变性会消失.如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基 酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同 时用于免疫组化和Western,而如果抗体 识别构象形表位,那么只能用于免疫组化.文档大全实用标准文案34、Western Blot中抗
13、体的可以重复应用 吗？答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但是如抗体比拟珍贵,可反复使用 23次.稀释后应在23天内使用,4度 保存,预防反复冻融.35、在做 Western Blot 时,PVDF 膜用甲 醇浸泡的目的？答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化 PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟 带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转 移时多加甲醇也是这个目的.36、检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的 抗原可以在同一张膜上吗？答：可以文档大全实用标准文案37、转膜后经丽春红染色的条带,为什么 大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好, 为什么？答：这是正常的,大分子的蛋白转移的慢, 你延长转移时
14、间和电流,大分子一端就会 好的多,但是小分子的就有可能会变淡.38、做 Western Blot时,同样的抗体免疫 组化能做出,而 Western Blot却不能？答：这多半是抗体的问题,要看抗体的说 明,是否能做Western Blot和免疫组化.39、如果是6刈转印膜,要加多少一抗？答：一抗的稀释度是有说明的,根据你的 一抗看看就知道了,但是那么大的膜孵育 体积一般最少为35ml.40、上下槽缓冲液有何要求,怎样才能达文档大全实用标准文案到最正确效果.答：无特殊要求.但我们一般是上槽放新 鲜的缓冲液,下槽可以是重复使用过一两 次的缓冲液41、跑电泳的时候配的胶总是 缩是什么 原因呢？是有的
15、成分不对吗？答：没什么问题,就是你胶里的水分被蒸发了.过夜时拿保鲜膜包起来,在里面加 点水保持湿度就可以了；也可能母液30%聚丙酰胺有问题,你可以重新配 制一份观察；能够替换的试剂,尽量换一下,选用好的试剂.42、蛋白质的分子量跨度很大,如要别离小21KD,中至66KD,大至170KD ,可以一次做好吗？答：这么广的分布不好转移,一般建议：文档大全实用标准文案21kd和66kd可以一起转,12% SDS-PAGE, 湿转 120mA, 45-60min就可以了, 可以根据你实验室的经验调 节；170kd 用 7%SDS PAGE, 200mA 90-120min.43、不能很好地将大分子量蛋白
16、转移到膜 上,转移效率低怎么样解决？答：可以考虑：转移缓冲液中参加20%甲 醇是指终浓度,由于甲醇可降低蛋白 质洗脱效率,但可增加蛋白质和 NC膜的 结合水平,甲醇可以预防凝胶变形,甲醇 对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移 缓冲液参加终浓度0.1%SDS,也是为了增 加转移效率；用优质的转移膜,或使用小 孔径的NC膜0.2微米.44、我用的是可视 marker,但是电泳总 跑不全8条带,请问什么原因？怎样改 善？胶用过8%, 10%, 12%,都是这样.文档大全实用标准文案marker是新买的.答：一般来说,是小分子量 Marker跑走 了,增加胶浓度或减少电泳时间试试看.当然梯度胶也是不错
17、的选择.45、是否Western Blot实验半定量一定要力口 ACTIN内参？答：对于发表文章的实验最好加内参,实 验严谨.46、核内抗原Western Blot内参选择什么 适宜？答：可以选用组蛋白,组蛋白在细胞核中 的表达是很稳定的,有很多都可以当成内 参,在网上查查就可以选出你要的内参.47、做半定量 Western Blot,内参 lactin, GAPDH哪个好？文档大全实用标准文案答：选用beta-actin就可以.48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原那么吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？答：一般来说提取时参加广谱的蛋白酶抑 制剂就可以了,操作时保持低温
18、.除非有 文献特别指明用特殊的方法,一般来说都 没有区别.49、转膜后的脱脂奶粉封闭液是 5%的TBST脱脂奶粉,其中TBST最后那个T是Tween吗,浓度多大？答：是 Tween,配方如下:Tris-BufferedSaline Tween-20 (TBST), NaCl: 8g, Trisbase: 2.42g 加水 800ml 溶解,加500-1000ul 的 Tween-20,用 HCl 调节pH 至7.4,加水定容至 1L.文档大全实用标准文案50、封闭,一抗,二抗时的温度有没有什 么规定呢,比方在室温里做,或者要在 4 度下？答：均可在室温进行,如果时间不够,一 抗孵育可以先在室温
19、进行一个小时,然后4度过夜.51、请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白 的原理是什么？答：一般而言,硝酸纤维素膜是通过疏水 作用来和蛋白质相联,这样的话,反复洗 几次后,蛋白容易掉下来,结果较差.PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白 接合,同时也有疏水作用,但相对较弱. 这样的话,PVDF膜和蛋白接合较牢,不 易脱落,结果较好.52、怎样才能把胶跑的非常漂亮,泳道都文档大全实用标准文案能很直,上样的量和灌胶是否很重要,电 压有什么要求？答：影响跑胶跑的质量,有以下几个因素： 1、电压,小的电压会使胶的分子筛效应 得到充分发挥.电压越小,条带越漂亮, 浓缩胶55v,别离胶75V就能跑得很好.2、 胶的均匀度,胶越均匀,条带越窄,别离 越均匀.倒胶之前,一定要充分混匀,玻 璃板一定要干净,双蒸水隔离时,一定要 比拟轻地加上去,预防稀释上层的别离胶.53、为什么提升大分子量蛋白的转移的时 候,小分子量蛋白会丧失一些哪？ 什么原 因？答：小分子的蛋白在转移过程中,会透过 膜去,所以大分子的上去以后,有一局部 小分子的就透过去了.文档大全