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1、脉冲场电泳技术 （PFGE） 培训王彤宇 培训部Mar-2014,CHEF脉冲场电泳的故障排除,PFGE Trouble Shooting,排除 PFGE 凝胶 故障 比较复杂，涉及到多种因素 : 实验室各自的技巧和技能 实验室环境和设备条件 试剂 水质 实验过程中意外的干扰和分心,（一） PFGE技术故障排除的一般考虑因素,通过改正一些不好的实验操作 （习惯） 能够帮助解决部分 PFGE 结果不佳的困惑 精准地 称量和 定容（积） 计算精确 确认所有仪器设备处于良好的工作状态 检查试剂化学品不得有沉淀、变色、絮状、过期 采用正牌厂家的试剂耗材 整个实验过程中戴手套 确认玻璃器皿干净， 不得有
2、清洁剂、脏物碎片等残留，因为这些因素可能会影响凝胶小块的制备、裂解，从而导致结果背景上出现 斑点，脏点 千万不要使用质量差的塑料容器， 除非你确保它能被洗干净 千万不要过分加热琼脂糖溶液 配置酶混合液时要混合充分 处理每种微生物实验时，采用合适的试剂、内切酶和电泳参数条件,（一） PFGE技术故障排除的一般考虑因素,想一想，对照上次成功的实验，有哪些因素变化了？过程方面：仪器设备试剂耗材人力因素考虑操作规程中的所有步骤，自检式提问是否故障源自于其中某一个环节？考虑和观察凝胶的每片区域，试图识别其中某个区域可能同失败的原因有关联要做到这些， 操作者必须对每一步骤的的目的很熟悉，以及对每一步错误的
3、操作可能带来的潜在后果明晰,（一） PFGE技术故障排除的一般考虑因素,（二） 模糊一片的条带 (Fuzzy or Smeary Bands),Smeary bands affecting samples alone or samples & standard,分析：这是很典型的假象造成原因是 蛋白酶消化 或 核酸内切酶切割 不完全 . 只有小胶块 的外周边缘接触到酶，得到了消化，而中心区域的样品却未被处理到位，所以样品电泳结果象个“盒子” 改进建议：小胶块做薄点；降低制作小胶块的琼脂糖浓度酶处理时间适当延长采用新鲜酶试剂增加酶的浓度,（二） 类似现象 或 称为 Box Shaped Band
4、s,（三）歪曲的条带 (Distorted Bands),小胶块放入样品孔时没放均匀稳妥。它们应该填满梳孔的整个宽度，胶块上沿须同大的电泳凝胶表面齐平。 “V” 形 或者 “ check mark” 形的条带是由于小胶块一端高出另一端而造成的 小胶块放到梳齿上后， 周围液体没吸干样品孔在灌制凝胶或拔出梳子时不小心扭曲循环泵的流速太慢检查连接管路有无扭结 或堵塞了出入口.,（三）歪曲的条带 (Distorted Bands),现象：液体样品加载到梳孔中， 如果出现长方形宽阔条带或是【 形， 往往由于顶部的凝胶比底部冷却快的原因，所以条带会倾斜 Liquid samples loaded to t
5、he top of the well produce a wide square band or doublet with sides (an open square shape). This is caused by the top of the gel being cooler than the bottom of the gel so that the band runs at a slant.,（三）歪曲的条带 Distorted Bands,微微歪曲的条带- 电极方面的问题,（三）歪曲的条带 Distorted Bands,歪曲的条带- 加样方面的问题,（三）歪曲的条带 Distor
6、ted Bands,歪曲的条带- 汽泡的原因 ?,（四） 样品没有往下方向迁移 Samples Not Migrating Down the Gel,样品没有进入凝胶:如果标准样品迁移正常的话, 有可能样品在前处理时没有酶解完全 电极问题 检测电流，电线连接，电泳时电极上的气泡 ，转换电场方向时样品虽然进入了凝胶，但在中途停了下来 :琼脂糖类型和浓度 ?主机电源参数有否变化 ? (比如, 输入电压值，电流值 ?)缓冲液类型和浓度 ?检查电路连接是否完好.在编有多套固定参数模块的方案中，仪器为第2套步骤自设的电压值为0.6 V/cm. 用户注意需要为第 1 套和第 2设置电压值,（四） 样品迁移
7、方向错误 Samples Migrate to the Wrong Direction,原因可能是程序错误，尤其在含有多状态参数组合的程序中出错。因为 multi-state 模式要求输入与垂直方向的夹角，一Samples are not going in the correct direction in the CHEF Mapper, the problem may be a programming error while in the Multi-State mode. The multi-state mode will ask for an angle from the vertica
8、l, rather than the included angle. So, for example, the researcher mistakenly programs in 120 degrees, then the sample will run in the wrong direction at a 30 degree angle.,（四） 样品迁移方向错误 Samples Migrate to the Wrong Direction,样品条带整体 偏向左侧或右侧， 可能的原因：电极断裂Broken electrode or electrodes.某对电极的电位有差异电泳槽的电子部分
9、由问题，比如，在槽盖的电插座上未连接通，靠这部分通路连接主机电源部分建议测量电极对的电压/电流 （拆、揭开电泳槽面, 24对电线）,（四） 样品迁移方向错误-条带倾斜,（四） 样品迁移方向错误 Samples Migrate to the Wrong Direction,（四）样品迁移方向错误 Samples Migrate to the Wrong Direction,（四）样品迁移方向错误 Samples Migrate to the Wrong Direction,样品条带整体 偏向左侧或右侧， 可能的原因：有时缓冲液循环回路有问题，由于琼脂糖碎片堵塞引起循环问题 建议凝胶放稳在胶框架内
10、，以免电泳是飘移；使用仪器原配胶框，自制的框不能太厚而阻挡电流使用 挡胶条，冲洗清洁整个管路和接口,（四）样品迁移方向错误 Samples Migrate to the Wrong Direction,原因： 凝胶外围人为地加了阻碍物体， 造成缓冲液循环不畅、波动，继而电场方向受影响,（四）样品迁移方向错误 Samples Migrate to the Wrong Direction,样品条带向外歪斜， 可能的原因：缓冲液量不够，没有盖没凝胶，梳孔使用时间长了，产生弯曲弧度，两侧由于琼脂糖碎片堵塞引起循环问题 建议加入大约2.1-2.2 升缓冲液；把梳齿反过来安装在固定架上。,(五) 蛋白酶K
11、消化步骤不完全没加Sarcosyl (十二烷基肌氨酸钠）,(五)蛋白酶K消化后没有充分洗胶块以去除碎片杂质,Same plugs washed 6X with TE,Smearing and incomplete restriction resulting from insufficient washing, 1st figure shows plugs washed 4 times with TE, 2nd shows plugs washed 6 times with TE.,问题: 不完全酶切反应会造成条带“重影”或称 “鬼影” ，可能的原因:小胶块质量差 proteinase K 没有
12、清洗去除干净DNA 浓度过高内切酶浓度内切酶商品/ 酶切缓冲液 批次质量问题 内切酶商品/ 酶切缓冲液 过期酶切孵育时间或温度条件错误,（六） 限制性核酸内切酶步骤 问题 Troubleshooting - Restriction Steps,10 Units,20 Units,40 Units,Incomplete digestion due to low enzyme concentration results in ghost bands. By increasing enzyme concentration to 40 units complete digestion was achi
13、eved.,Ghost bands,建议: 多用 TE 洗 2 次 小胶块 确保体系中加入足够的酶- 增加酶单位 确认 DNA 浓度没有过高，从第一步减少菌体液开始，或者切小点、薄点的小胶块,（六） 限制性核酸内切酶步骤 问题 Troubleshooting - Restriction Steps,Complete Digestion,建议: (continued): 配置酶切预混液的内切酶和缓冲液必须高质量-注意保存条件，不能使用过期的,酶孵育时间过长 (过夜），就出现了 “星晕状-Star Activity ）现象；同样的酶 （Ascl)反应2小时，则没有,* Barany, F. (19
14、88) Gene 68, 149,（六） 限制性核酸内切酶步骤 问题 Troubleshooting - Restriction Steps,E. coli O26, BlnI,其它酶切问题: 有些菌株DNA 无法被酶切， 是因为它没有特异性酶识别位点或无法接触特异性位点没接触。 这种现象往往是看到在凝胶上端（靠近梳孔） 聚集着DNA 样品，而泳道中既无条带，也没拖尾建议: 用同样的酶消化另一胶块，确认并不是先前的那块有问题，（如先前实验时忘记加入酶， 或没有接触到酶反应液 如果仍然看到如此现象时，可以帮助确定该酶与菌株的适用性问题,For E.coli O26 single band was
15、 confirmed to be a valid pattern,（六） 限制性核酸内切酶步骤 问题 Troubleshooting - Restriction Steps,SfiI,NotI,Lanes 2 4, 6 and 7 are smears caused by expired enzyme that did not cut DNA. The same plugs cut with NotI enzyme yielded distinct bands, indicating that the plugs were fine and smears were due to using e
16、xpired enzyme.S = standard,提示: 如何判断不完全酶切是由于酶或buffer 质量造成的 ？ 采用另一种酶 （以前实验成功验证过）或同样品种但不同批次的酶 ， 对同批样品进行酶切测试 加入 牛血清白蛋白 (BSA) ，即使该酶的供应没有提及。因为在酶切过程中既能够帮助酶保持稳定，又能够减少由于抑制剂存在造成酶失活和防止酶粘附在管壁上的活性,（六）限制性核酸内切酶步骤 问题 Troubleshooting - Restriction Steps,Without thiourea,With thiourea,（六）限制性核酸内切酶步骤 问题依赖于硫尿处理 或 无法分型的菌
17、株,Tris-缓冲液在电泳过程中产生的一些氧化物质，某些菌体本身在酸性缓冲液中容易降解，硫尿作为一种还原剂能中和氧化物质，改善条带分型或一片模糊拖尾现象用于对某些难以进行条带分型的菌株适用。,The same plugs were used in both gels. Lanes 3, 4, 6, 7, 8 and 9 are thiourea-dependent.,建议: 在凝胶中加上阳性对照 用曾经验证过的， 依赖于硫尿帮助分型的菌株 DNA 样品 小胶块. 用了这个阳性对照后， 证明 无法分型的原因同其它，如制胶块，试剂等无关。只是系统中需要硫尿 如果DNA质量不好, DNA 将滞留在孔
18、内，即使加入硫尿也无济于事. 加入 50M thiourea (i.e. 10mg/ml 母液取873ml) 直接加入到 (0.5X TBE)， 然后电泳. 只在少部分菌株分型中需要，并非常用 Use only when needed (with known strains or suspected serotypes) and not routinely.小心: 硫尿是变性剂， 使用和丢弃时 格外小心，须按照有毒有害废品管理规范处理,（六）限制性核酸内切酶步骤 问题依赖于硫尿处理 或 无法分型的菌株,Old culture48 hrs,Fresh culture18 hrs,PFGE gel
19、 from fresh culture shows no smearing and all bands are distinct. Lysed cells are present in 48 hour old cultures (same organism), characterized by smears on the PFGE gel (blue arrow).,Potential problems: Undue stress to bacterial cells prior to casting the plug can cause cell lysis, leading to DNA
20、degradation and is characterized by “smearing” on the gel. Recommendations:Grow cultures on non-selective mediaUse fresh cultures grown for 14 18 hours at appropriate temperature and conditionsDo not let cultures sit at room temp for more than an hour before making cell suspensionsDo not store cultu
21、res at 4C before making cell suspensionsDo not use cultures grown for more than 18 hours (contain lysed cells)Do NOT centrifuge or vortex cell suspensionsDo NOT leave bacterial cell suspensions at room temp for extended periods of time prior to casting plugs,（七） 起始的菌体悬液质量 Preparing cell suspension,（
22、八） 制作包埋菌体的小胶块步骤,When agarose is reheated, water evaporates and the agarose concentration increases, resulting in plugs that do not have the expected agarose percentage. Reheating the agarose 6 times increased the concentration from 1% to 2%.S = standard,Potential problems:Agarose that is too hot may
23、 damage the cellsAgarose thickens and solidifies as it cools, making pipetting difficult and leading to an uneven distribution of cells within plugsRecommendations:Equilibrate melted agarose to 50 54C and keep warm while casting plugs.Limit mechanical force (pipetting) when mixing melted agarose wit
24、h cell suspensions.Do not re-use plug agarose more than 3 or 4 times. Repeated heating results in loss of fluid and increases the agarose concentration.,反复熔化包埋用琼脂糖浓度增加,2.0%,Exposure time:Too short = difficulty visualizing faint, bottom bandsToo long = Increased background, loss of distinction betwee
25、n closely migrating bands,（九） 图象采集步骤Image acquisition,（十）其它的问题 循环通路中有气泡Air Bubble Accumulating,通常循环速度慢造成检查管路和连接部分。可能部分管路有裂缝容易使空气进入检查管路中不要被东西堵塞建议更换管路，尝试采用外管直径更小点的管子，并检查所有连接处密封性好如有堵塞，反向冲洗清洁琼脂糖碎片堵塞引起 ，使用 挡胶条.,（十）其它的问题 Lambda DNA 标准品 没有清晰的条带,小片段部分模糊/丢失- Lambda ladder marker (DNA）片段被另一堆DNA 在顶部混淆污染了.如何修复Lambda ladder marker :在微型离心管内先加入 0.5 ml of 0.5 x TBE 切小块 DNA ，尺寸与样品孔大小相似，放入含TBE 的微型管内，确认胶块浸在液体下面把微管放置在 45 C 水浴或加热 10分钟再将微管放在冰上，直到加样品孔中,（十）其它的问题无法启动电泳 或死机 (Unable to Start a Run),仪器 死机.在程序设置中的某一步停滞无法修复的错误-重设时间按住, 键，等待仪器鸣响 6 秒后，重启仪器,PFGE技术的故障排除 ,参考仪器操作说明书的第11章节,Thank you!,PFGE技术的故障排除 ,