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1、1. 柱平衡步骤：向吸附柱 CP4中（吸附柱放入收集管中）加入 500 Z 的平衡 液BL, 12000 rpm （13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新 放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）2. 取5-15ml过夜培养的菌液加入离心管中，12000 rpm （13400g ）离心1 min， 尽量吸除上清。3. 注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中，菌体量以 能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。4. 向留有菌体沉淀的离心管中加入500 L溶液Pl （请先检查是否已加入RNaseA ），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细
2、菌细胞沉淀。 5. 注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。质粒6. 向离心管中加入500L溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注 意：温和地混合不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠， 所用时间不应超过5 min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体 过多，裂解不彻底，应减少菌体量。=|*卢X7. 向离心管中加入700 L溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此 时会出现白色絮状沉淀。12000rpm （ 13400g ）离心10 min，此时在离心管底 部形成沉淀。8. 注意：P3加入后应立即
3、混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。9. 将上一步收集的上清液分次加入过滤柱Cs （过滤柱放入收集管中），12000rpm（13400g ）离心2 min，小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中），（如果过滤柱中有残余的液体说明步骤 5吸取 的上清中杂质过多，可以延长离心的时间；如果离心后收集管底部有少量的沉 淀.尽量地吸取上清)。10.12000rpm (13400g )离心I min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。11. 向吸附柱 CP4中加入500L去蛋白液PD 12000rpm (13400g)离
4、心I min,倒 掉收集管中的废液，将吸附柱 CP4放入收集管中。12. 向吸附柱 CP4中加入600L漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm (13400g)离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。注意：加入漂洗液 PW后，如果室温静置2-5 min，有助于更好地去除杂 质。13. 向吸附柱CP4中加入600卩L漂洗液PW , 12000rpm (13400g)离心I min，倒掉 I X 1 % 卢收集管中的废液。厂./ X14. 将吸附柱CP4重新放回收集管中置于12000rpm(13400g )离心2 min,目的是 将吸附柱中残余的漂洗液去
5、除。15. 注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保,-j I/丿下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP4开盖，置于室温放置数 min,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。16. 将吸附柱自科置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 100-300L 洗脱缓冲液 TB，室温放置 2 min, 12000rpm (13400g )离心 I min 将质粒溶液收集到离心管中。17. 注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中.重复 步骤12。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5 范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100L,体积过小影响回收效率。且DNA产物应保存在-20 C，以防DNA降解。质粒DNA浓度及纯度检测：得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。电泳可能为单一条带，也可能为2到3条DNA条带，这主要与提取物培养时间长短、提 取时操作剧烈程度等有关。OD260值为I相当于大约50g/ml双链DNA。OD260 / 0D28。比值应为1.7 -1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。