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1、新型抗CD133xCD致特异性抗体治疗晚期结直肠癌的基础研究目的：构建并表达纯度较高的抗CD133xCD或特异Tt抗体，通过体内及体外实验检测其对结直肠癌细胞的靶向杀伤效应,并探讨其可能的作用机制,期待为晚期结直肠癌患者找到一种更安全有效的治疗方法。方法：1.利用基因重组技术构建人鼠嵌合型抗人CD133xCD双特异Tt抗体(MS133)及抗人CD13W克隆抗体(AC133)。2.利用瞬时转染表达MS133RAC133通过ProteinA亲和层析和SP阳离子交换层析纯化抗体,Westernblot检测蛋白表达，SDS-PAGEf口SEC-HPL险测抗体纯度。3.通过流式的方法检测MS13盼别与细
2、胞表面抗原位点CD133WCD3的结合能力，并利用CFSEPI染料进行细胞染色，检测MS13也被激活的T细胞(activatedTcell,ATC)对结直肠癌细胞(HCT116HT29.SW480的杀伤情况和对正常组织细胞MCF-10A勺毒性效应。4.选取CD133W表达细胞株HCT11纵研究对象，使用CCK8式齐盒检测MS133对其增殖的影响,并通过定量ELISA的方法检测细胞杀伤过程中相关细胞因子(IFN-y、TNF-aGM-CSFIL-4)的分泌情况。5.为了验证MS133B勺体内药效，我们建立了两种重症免疫缺陷小鼠(NOD/SCID功物模型，首先是MS133&被ATC细胞与HCT11虺
3、田胞混合共注射模型；更进一步验证是将HCT116M胞与ATC细胞混合接种于小鼠皮下，尾静脉抗体(MS133hOKT3hIgG)给药模型。结果：1.制备的双特异性抗体MS13盼别用SDS-PAGEDSEC-HPLC佥测，纯度为84%口95%,抗体产量约为10mg/L。2.MS133CD3阳性细胞(Jurkat、ATC)和CD133阳性细胞(HCT116HT29典能很好的结合。MS13被ATCffi胞可高效杀伤CD133s表达结直力癌细胞株HCT11侨DHT29,对CD133（氐表达结直力癌细胞株SW48吸正常组织细胞株MCF-10烦伤作用弱3.在效应细胞与靶细胞比例较高时，MS133表现出显著的
4、HCT11V曾殖抑制效应。另外,MS133靶向杀伤HCT116程中，产生较高水平IFN-y、GM-CS蒯胞因子的分泌。4.小鼠体内实验中，MS133包被ATCffi胞可完全抑制小鼠移植瘤的生长；此外，低剂量MS133a射可显著抑制小鼠移植瘤的生长，瘤体积及瘤重均小于单抗治疗组,并且小鼠体重未出现明显变化。结论：1.MS133体外包被激活的T细胞可有效杀伤CD133a表达结直肠癌细胞，杀伤作用的强弱与细胞表面CD133表达水平相一致。2.MS133包被ATC细胞可特异性杀伤CD133高表达结直肠癌细胞，并且对CD133氐表达的结直肠癌细胞和正常组织细胞毒性作用较小。3.MS133介导ATCffi胞靶向杀伤CD133a表达结直肠癌细胞HCT116勺同时,IFN-r和GM-CS分泌量也明显增加，可能是MS133W效杀伤月中瘤细胞的一个机制。4.小鼠体内实验证实，MS133介导ATC细胞的靶向杀伤能够有效抑制小鼠HCT11卷植瘤的生长。因此,MS133作为一种新的治疗性抗体，对于靶向治疗晚期结直肠癌具有良好的应用潜能。