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1、气相色谱法测定参苓白术散中樟脑、龙脑及乙酸龙脑酯含量DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.021参苓白术散出自太平惠民和剂局方，2009年收载入国家基本药物目录，现收载于2010年版中华人民共和国药典（一部）。处方由人参、茯苓、白术、山药、白扁豆、莲子、薏苡仁、砂仁、桔梗、甘草共10味药组成，为全原粉入药，有补脾胃、益肺气的功效，主要用于脾胃虚弱，食少便溏，气短咳嗽，肢倦乏力1。其中砂仁有醒牌和胃、行气化滞的功效，其挥发性成分为有效成分，在制剂中发挥其药理作用。砂仁的主要成分为龙脑、樟脑、乙酸龙脑酯，可选择以上3种作为指标性成分，测定其含量，达到控制砂仁药材
2、质量的目的1。目前参苓白术散质量标准未收载含量测定项，有文献报道对处方中人参、甘草的含量进行了研究2-3，但未对砂仁的有效成分进行测定。本试验建立参苓白术散中龙脑、樟脑、乙酸龙脑酯的含量测定方法，并对收集到的13家企业生产的29批制剂进行测定，为控制其质量提供依据。1 仪器与试药Agilent6890气相色谱仪（美国安捷伦公司），氢火焰离子检测器（FID,美国安捷伦公司）；MettlerToledoAG135十万分之一电子分析天平（瑞士METTE於司）樟脑对照品（供含量测定用，批号110747-201008，按99.0%计）、龙脑对照品（供含量测定用，批号110881-200706，按99.2
3、%计）、乙酸龙脑酯对照品（供含量测定用，批号110759-200303），均由中国药品生物制品检定所提供。试剂均为分析纯，水为去离子水。参苓白术散为市售的13家企业生产样品的抽样29批（生产企业以字母代替，批号以数字代替）。2 方法与结果2.1 色谱条件100%甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱，程序升温（起始温度60C,以5C/min升到130C,保持5min,续以20C/min升到230，保持5min），柱流量1.1mL/min，分别设定进样口、FID检测器温度为3004-6。2.2 对照品溶液的制备精密称取樟脑对照品9.52mg,置10mL容量瓶中，加乙酸乙酯使溶解，并稀释至刻度，作为樟脑贮
4、备液。精密称取龙脑对照品12.15mg,置10mL量瓶中，加乙酸乙酯使溶解，并稀释至刻度，作为龙脑贮备液。精密称取乙酸龙脑酯对照品30.27mg，置100mL量瓶中，加乙酸乙酯使溶解，并稀释至刻度，作为乙酸龙脑酯贮备液。精密吸取樟脑贮备液2mL龙脑贮备液1mL乙酸龙脑酯贮备液各5mL,置50mL量瓶中，加乙酸乙酯使溶解并稀释至刻度，摇匀，即为混合对照品溶液。2.3 供试品溶液的制备取本品6g,精密称定，至圆底烧瓶中，连接挥发油提取器，加水200300mL并从发油提取器上方加入乙酸乙酯1mL加热回流1h。吸取挥发油提取器中乙酸乙酯液置5mL容量瓶中，再用乙酸乙酯3mL分次洗涤挥发油提取器，并入5
5、mL量瓶中，用乙酸乙酯稀释至刻度。色谱图见图1。2.4 空白试验按处方中药味比例，配制不含砂仁的诸药，按其制法制成空白制剂，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液，按上述色谱条件测定，进样量1?L。结果阴性对照溶液在与樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯对照品相同保留时间处，未显示色谱峰，认为无干扰。见图1。2.5 线性关系考察精密吸取含0.03770mg/mL樟脑对照品、0.0241mg/mL龙脑对照品、0.03027mg/mL乙酸龙脑酯对照品的混合溶液0.1、0.2、0.3、0.5、1、3、4?L，注入色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：樟脑Y
6、=0.00006X-0.00036，r=0.9999(n=6)；龙脑Y=0.00005X+0.00021,r=0.9999(n=6);乙酸龙脑酯Y=0.00007X-0.00022,r=0.9999(n=6)。结果表明，樟脑在0.003770.1508?g范围内、龙脑在0.0024110.0964?g范围内、乙酸龙脑酯在0.003020.1211?g范围内线性关系良好。2.6 重复性试验分别精密称取6份样品（H企业生产，批号为4），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，注入气相色谱仪，樟脑峰面积的RSD=1.8%龙脑峰面积的RSD=1.9%乙酸龙脑酯峰面积的RSD=1.9%表明本方法测定供试品中
7、樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯的含量重复性较好。2.7精密度试验精密吸取同一供试品溶液1?L，注入气相色谱仪，重复进样6次，结果樟脑峰面积的RSD=0.42%，龙脑峰面积的RSD=0.51%，乙酸龙脑酯峰面积的RSD=0.49%表明精密度良好。2.8 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液，分别于配制后0、4、20h，依法测定，结果表明，供试品溶液在20h内基本稳定。樟脑峰面积的RSD=1.2%龙脑峰面积的RSD=1.7%乙酸龙脑酯峰面积的RSD=3.1%表明本法稳定性良好。2.9 加样回收率试验采用加样回收法，精密称取已知含量的同一批样品（樟脑含量为0.07379mg/g，龙脑含量为0.01978mg/g
8、，乙酸龙脑酯含量为0.02795mg/g）3g,精密加入混合对照品溶液（含樟脑0.2404mg/mL，龙脑0.05861mg/mL，乙酸龙脑酯0.0928mg/mD5mL平行制备6份，依法测定，结果表明均具有良好的准确度。见表1表3。2.10 样品含量测定按照上述测定方法，对市售的13家企业29批次参苓白术散进行检验，结果见表4。3 讨论2010年版中华人民共和国药典（一部）“砂仁”项下仅规定了乙酸龙脑酯的含量，经查阅文献报道，不同来源的砂仁中均含有樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯，但含量高低不同，故拟定以3 种含量总和计。不同来源的砂仁挥发油含量不同，药典规定的挥发油含量最低不少于1%，文献报道的3种
9、成分总和最低可占总挥发性成分的50%5，故以此来推算砂仁中3种成分总量的理论值。散剂中砂仁为原粉入药，无提取工艺，但由于挥发性成分不稳定，考虑到标准检验中无此含量测定项，生产企业在工艺上亦未对此成分进行控制，故3种成分总量转移率按不低于80%计算，拟定制剂中含樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯总量应不得少于0.25mg/g。本试验对提取时间进行了考察，取同一批号的样品适量，连接挥发油提取器，加入乙酸乙酯1mL,分别回流提取1、2、3、4 h，依法测定，结果回流提取1h效率最高，3种成分可提取完全。通过对29批样品中砂仁的含量测定，发现各生产企业存在较严重的问题：由于现行标准未规定砂仁的含量测定项，导致部分企业投料用药材的质量不符合规定，或灭菌工艺不合理导致挥发性成分大量损失，或擅自改变工艺等现象的发生。因此，有必要制定砂仁的含量测定项，从而对砂仁的质量及药品的有效性进行评价。本研究所建立的砂仁含量测定方法可操作性、可控性较强，建议在新的质量标准中增加砂仁的含量测定项。