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1、新生仔猪腹泻综合征(NPDS)研究初探韩健宝1、2 邓小红 1、3（1、楠森兽医诊断技术研究中心；2、南京农业大学动物医学院；3、扬州大 学兽医学院江苏 南京，210095）摘要:近来，众多猪场出现新生仔猪腹泻高发病情况，应用抗生素治疗无明显效果，死亡率很高，有些严重发病的猪场哺乳仔猪整窝出现腹泻相继死亡，导致猪场损失惨重。猪群发病特点表现为母猪与新生仔猪同时具有临床症状，母猪主要表现为产前产后便秘，产后发烧不食、少奶甚至无奶、拉水样粪；新生仔猪初期表现为黄色水样或溶糖状腹泻物，有臭味，腹泻、呕吐，进而转变为剧烈水样腹泻、允乳无力、仔猪体质快速瘦弱最后衰竭死亡。鉴于此严重情况， 我楠森兽医诊断
2、技术研究中心立即组织专家力量，在全国范围内深入各地猪场做临床调查并取发病仔猪病料开展实验室诊断。关键词: 新生仔猪、病毒性腹泻、肽核酸我中心在与泰国等东南亚地区农场及国内众多猪场交流后发现这种新生仔猪的腹泻问题相当普遍，对养猪生产已造成了不小损失，需引起同行重视并尽快研究出控制措施与方案。经过临床调查结合实验室诊断研究分析， 近来的产房母猪和新生仔猪腹泻病症主要与多种病毒共感染相关，故暂命名为“新生仔猪腹泻综合征(NPDS)”。由于病毒持续侵染母猪淋巴系统和生殖系统，形成感染压力后致使母猪免疫机能衰弱，便秘、体况不良、食欲不佳、产程过长、奶水不足、产道感染率增加等一系列亚临床症状及死胎、流产、
3、返情率增高等繁殖障碍现象。受病毒感染压力的影响，在妊娠后期病毒易通过胎盘屏障垂直传染给胎儿几率增加，新生仔猪先天性带毒及出生后即在母猪排毒污染严重的环境中与母猪一起生活，免疫系统频繁遭受病毒攻击致使原本尚未发育成熟的免疫系统损伤严重，再加上目前是冬春季节交换，日夜温差与气候变化剧烈，故出现新生仔猪腹泻高发病高死亡率。为探究发病原因，我们将从广东、广西、福建、江西、湖南、江苏、安1作者简介：韩健葆（1980- ），男，博士生，主要从事兽用核酸与多肽类生物抗病毒免疫增强药物和功能性饲料添加剂研究和开发，E-mail: hjb。徽、湖北、河南共 9 个省区采集的 28 个病料样本（十二指肠、淋巴结、
4、肺脏、扁桃体、血液）处理，尝试分离猪瘟病毒、蓝耳病病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒、流行性腹泻病毒。一、 病料处理分别取解冻的待检病料 10g 左右（在冰上进行操作），用灭菌的手术剪剪碎，加入适量的生理盐水或 PBS 溶液（pH7.2)混匀，用灭菌的研磨器充分研磨，再用 2ml Eppedorf 管分装，反复冻融 2-3 次，4冷冻离心机离心 8000r/m， 10min，取上清液，置-70保存备用。二、 病毒液、病料中病原 DNA 模板的制备2.1 圆环病毒及伪狂犬病毒的 DNA 提取取 447.5ul 上清液，加 50uL10%的 SDS，震荡混匀；加入 2.5uL 蛋白酶（PEK），混匀；放入
5、 58水浴锅中，充分裂解 2h，再加入水饱和酚 250ul，三氯甲烷 240ul，异丙醇 10ul，混匀，12000 转/分离心 5min；取上清 400ul 加 1/10 体积的醋酸钠 40ul，2 倍体积的无水乙醇 800ul，混匀，置于-20进行 DNA 沉淀 1h；12000r/m 离心 20min，弃去上清，加入 1000ul 70%乙醇洗涤沉淀，再弃去上清进行干燥，干燥后加入灭菌双蒸水 50ul 将 DNA 溶解，-20保存备用。2.2 猪瘟病毒、蓝耳病病毒及轮状病毒的 RNA 提取及反转录采用天泽基因生产的柱式动物RNAout 试剂盒提取样品RNA。按照说明书提取，样品管中A 液
6、和 B 液各加 450ul，再加入 300ul 样品上清液，混匀； 加氯仿 250ul，混匀，12000r/m 离心 5min，取 700uL 无色透明水相于通用离心柱中，12000r/m 离心 1min，加入通用洗柱液 700ul，再重复离心步骤；弃去离心吸附柱，换成离心管，每管加 50ul 洗脱液，再次离心 1min，-20保存备用。将 RNA 反转录成 cDNA， 反应体系： DEPC 6uL+RNA 5ul+ 引物1ul+dNTP 2ul,65反应 2min，在降温至 4保持 5min。再向反应管中加入5*buffer 4ul+Ribolock Rnase Inhibitor 1ul+
7、M-MLV 1ul，30反应 10min。三、 引物设计与合成根据基因文库提供的和已发表的 CSFV、PRRSV、PRV、PCV2 和 PEDV 序列，应用计算机软件DNAstar 在保守区域基因序列保守区的五对引物。该引物设计完成后, 通过计算机网站(http:/www.ncbi. Nlm.nih.gov/BLAST/)对其进行分析，结果具有良好的特异性。引物序列如下：CSFV上游引物:5-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3 下游引物:5-TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3PRRSV 上游引物: 5-GCGGATCCATGCCAAATAACAAC-3 下游引物: 5-
8、AGCTCGTTTCATGCTGAGGGTGA-3PRV上游引物: 5-AGGACGAGTTCAGCGACG-3下 游 引 物 : 5-AACAGGCGGTTGGCGGTCAC-3 PCV2上游引物: 5-GACCTGTCTACTGCTGTGAGTA-3下游引物: 5-AAATTCAGGGCATGGGGGGGAA-3 PEDV上游引物:5-GTATGGTATTGAATATACCAC-3下游引物:5-GATCCTGTTGGCCATCC-3四、 PCR 扩增及鉴定采用天泽基因PCR 试剂盒，30ul 反应体系：DNA（cDNA） 2-4uL+PCR Mix 15ul+引物 1-2ul+灭菌双蒸水
9、9-11ul，采用 95预变性 5min，9450s，52-59 不同温度进行退火 50s，72延伸 1min，共 35 个循环；最后 72延伸 10 min， 产物 4保存。五、 结果与分析病原分析结果如下（表 1.）六、预防控制思路新生仔猪腹泻综合征（NPDS）病原分离结果（n=28）病料带毒率%病毒病料猪瘟病毒（HCV）蓝耳病毒(PRRSV)圆环病毒(PCV2)伪狂犬病毒（PRV）流行性腹泻病毒（PEDV）淋巴结23（82%）20（71.4%）27（96.4%）14（50%）16（56%）十二指肠10（35%）5（17.85%）18（64%）12（43%）20（71.4%）肺脏11（39
10、.2%）26（92.8%）23（82%）19（68%）0（0%）扁桃体26（92.8%）0（0%）5（17.85%）0（0%）1（3.6%）血液21（75%）23（82%）12（43%）16（57%）9(32%)据调查研究显示，我国及东南亚地区目前新生仔猪腹泻高发病率高死亡率与母猪群遭受野毒持续侵染，形成感染压力呈正相关，凡是便秘、体况不良、食欲不佳、产程过长、奶水不足、乳房炎与子宫炎及返情、产死胎率高的母猪群所产的新生仔猪发生腹泻病率显著的增高。另外,国内猪场母猪贡献成品肉猪的生产水平普遍不到发达养猪国家的 60%，大量的种猪存在不同程度的繁殖障碍，由于母猪的生产性能低下，又加上疾病的频频发
11、生，猪场的盈利危机四伏。在猪场中有着相当多的公猪表现死精、弱精、甚至无精；母猪表现出的屡配不孕、死胎、流产、产弱仔、便秘、奶水不足、采食量不正常等亚临床现象。存在的这些现象中，有超过 80%是由于野毒在种猪群中循环并持续侵染种猪的生殖系统上皮细胞，导致卵巢、输卵管、子宫、精囊腺、睾丸等组织器官细胞大量凋亡。俗话说的好，母猪好好一窝、公猪好好一坡，在哺乳母猪饲喂过程中， 采用益百特（肽核酸-一种新型的抗病毒免疫调节功能性添加剂）添加到哺乳母猪料中（产前三周至断奶），对母猪群实施病毒感染良好控制与净化方案是解决如“新生仔猪腹泻综合征(NPDS)”、“母猪繁殖障碍综合征”这些问题的关键！七、发病猪群
12、临床控治措施产房新生仔猪腹泻主导病因为受母体病毒感染压力影响，故在处理产房新生仔猪腹泻时不能仅仅针对仔猪用药，必须采用益百特来同时出处理产房母猪和新生仔猪，只有从源头上（哺乳母猪）控制（减少母猪通过粪便排毒污染环境及通过乳汁排毒饲喂乳猪），才能有效控制新生仔猪腹泻，具体措施如下：A:母猪，产前三周开始添加益百特至断奶；B：发病猪肌注疫百特TM 注射液+阿托品(功能:缓解消化道平滑肌蠕动、止泻)，两天一次，连续肌注 3 次。 母猪，分娩当天肌注疫百特 TM 注射液 6-8ml/头份，间隔 3 天各肌注一次，1-2 次/疗程。 吃奶的新生仔猪，肌注疫百特 TM 注射液 0.1ml/头份（3kg 体
13、重） 、0.2ml/头份（3-7kg 体重），可与疫苗或补铁同针肌注，间隔 2 天各肌注一次， 2 次/疗程；或疫百特 TM 注射液 0.2ml+ 霉克乐 5-10g/头份灌服（即：以 10 头猪/窝计，分别取疫百特 TM 注射液 2ml 和霉克乐 50-100g 加入 200ml 热开水中搅拌形成混悬液，用一次注射器吸取 20ml 灌入乳猪口中咽下，1-2 次/ 日。） 能够采食的发病猪群采用益百特TM （拌料型） 1000g+ 君特泰克 （拌料型） 3000g+霉克乐3000g/吨全价料，连续饲喂 7-10 天或益百特 TM （水溶型）500g+ 君特泰克 （水溶型） 300g+电解多维连续饮水 7 天，霉克乐3000g/吨全价料，连续饲喂 7-10 天。 搞好猪圈环境卫生、干燥、温暖。