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1、培养基适用性检查 计数实验的培养基适用性 该部分内容均为新增 规定了该内容的应用范围 采用标准菌种计数，回收率以及形态比较的判定方法 标准菌种为：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；规定了稀释后的工作菌液的保存条件和保存期限 引入了对照培养基的概念 判定的依据：回收率大于70，且形态一致 控制菌检查的培养基适用性 该部分内容均为新增 规定了该部分内容的应用范围以及检查的项目 采用标准菌种比较的判定方法 根据培养基的用途不同，分为增菌培养基的促生长能力、固体培养基的促生长能力、培养基的抑制能力、固体培养基的指示能力、液体培养基的指示能力等5种检查方法 在检查中引入了涂布
2、接种的概念1. 概述培养基质量是影响微生物检验结果的重要环节。计数测定用培养基的促生长能力是微生物限度检查结果判断的重要影响因素，控制菌检查用培养基也可能由于其促生长能力、指示能力、抑制能力的差异，从而对菌落颜色、形态等指标存在较大差异，影响结果判断的客观性。培养基适用性检查是通过检验用培养基与对照培养基的比较，以阳性菌的生长状态或特征来评价拍段检验用培养基是否符合检验要求。微生物限度检查用培养基主要分为细菌、霉菌及酵母菌计数测定用培养基和控制菌检查用培养基两部分。2010版中国药典微生物限度检查法中收载了“适用性检查”对培养基质量进行控制。2、培养基适用性检查实验的一般要求2.1培养基适用性
3、检查适用范围2010版中国药典规定微生物限度检查中成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。培养基使用性检查试验可用于确定实验室所用培养基(包括购置的不同批号的成品培养基、不同批号的脱水培养基干粉、按处方自行配制培养基不同批次的原材料等)、制备程序（包括水质控制、配制方法、灭菌程序等）、保存条件（温度、湿度、时间及盛装培养基的容器条件等）等是否满足微生物限度检查用要求。即上述影响培养基质量的各关键控制点应通过培养基使用性检查试验确定，如果任一控制点发生变化应重新进行培养基适用性检查。但是影响培养基质量的关键控制点的变化应掌握在微生物实验室质量控制的一般原则内（见2.
4、2），超过一般原则的培养及是否还能满足微生物限度检查用，无法通过培养基适用性检查确定。当检查结果出现异常，或实验室质量控制需要，也可通过培养基适用性检查提供一定依据。总之，培养基适用性检查是在正常条件下关于培养基质量的实验室控制措施，并不一定在每次具体的微生物限度检查样品检测试验活动中都必须同时进行培养基使用性检查试验，但每次微生物检查所用培养基均应经过适用性检查。2.2微生物限度检查用培养基质量控制的一般原则2.2.1不同处方培养基的替代使用不能通过培养基使用性检查试验简单确定。2.2.2.培养基适用性检查不能取代供应商或其他法定标准对培养基的有效期、保存条件、制备方法等的更严格等的规定。2
5、.2.3.如果没有特殊规定，培养基配制采用蒸馏水或纯化水均可，但应采用一定措施加以检测控制，如蒸馏水应核实PH是否为57；采用离子交换法制备的纯化水，电阻值应不小于2M等。2.2.4尽量临用现配。培养基灭菌后在能取出的前提下，尽快取出，切忌在高压锅内过夜存留；固体培养基灭菌或融化后，融化状态放置不得超过8h；一般预制培养基可置洁净环境225保存，但不应超过20天；固体琼脂培养基熔化再使用应不超过一次。2.2.5干粉培养基或培养基原料变质不应再用；预制培养基储存过程中发现浑浊、变色、长菌、严重脱水等变化不应再用。2.3对照培养基对照培养基应通过严格的质量研究和控制，具备性能稳定、质量优异的特点。
6、对照培养基作为一种标准试剂，应具备可靠的来源和保障。2.4培养基适用性检查指标及常用方法2.4.1检测指标：促生长能力、指示能力、抑制能力。2.4.2常用方法：直接接种法、浇碟法、表面接种法（涂布法）。2.4.3液体培养基通常采用直接接种法测定上述3种指标，接种时应注意接种量不得超过培养基体积的10%。固体培养基采用浇碟法和表面接种法测定上述指标。采用浇碟法考察固体培养基时，为了保证取样的平行性，平行测定两皿求平均数；采用表面接种法考察固体培养基时，表面接种菌液不多于0.2ml/皿，尽量控制在0.1 ml/皿，保证取样的平行性，平行测定两皿观察结果。3.计数培养基的适用性检查微生物限度检查中计
7、数用培养基3种，营养琼脂、玫瑰红钠营养琼脂和酵母浸出粉葡萄糖琼脂。3.1计数培养基适用性检查试验菌株。大肠埃希菌CMCC(B)44102金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501白色念珠菌CMCC(F)98001黑曲霉菌CMCC(F)98003菌株培养基菌液制备同微生物限度检查方法验证。3.2实验操作3.2.1培养基制备 按规定程序新鲜配置营养琼脂（被检培养基和对照培养基）、玫瑰红钠营养琼脂（被检培养基和对照培养基）以及酵母浸出粉葡萄糖琼脂（被检培养基和对照培养基），灭菌后备用。3.2.2营养琼培养基 取7个无菌平皿，分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢
8、杆菌各2皿，每皿接种1ml菌液（含菌50100cfu），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注对照营养琼培养基，混匀，凝固后于3035倒置培养48h,计数；被检培养基同法操作。3.2.3玫瑰红钠营养琼脂 取5个无菌平皿，分别接种白色念球菌、黑曲霉菌各2皿，每皿接种1ml菌液（含菌50100cfu），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注对照玫瑰红钠营养琼脂，混匀，凝固后倒置培养72h,计数；被检培养基同法操作。3.2.4酵母浸出粉葡萄糖琼脂 取3个无菌平皿，分别接种白色念球菌2皿，每皿接种1ml菌液（含菌50100cfu），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注对照酵母浸出粉葡萄糖琼脂，混匀，凝固后倒置培
9、养72h,计数；被检培养基同法操作。3.3结果判断若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致，则判断该培养基的适用性检查符合规定。4.控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配置的培养基均应检查。检查项目包括培养基的促生长能力、指示和抑制特性能力。4.1计数培养基适用性检查试验菌株。大肠埃希菌CMCC(B)44102金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003铜绿假单胞菌CMCC(B)10104乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)50094白色念珠菌CMCC(F)98001枯草芽孢杆菌CMCC(B)63
10、501菌株培养基菌液制备同微生物限度检查方法验证。4.2各种培养基需要测试的能力及判断指标液体培养基促生长能力检查：取不大于100cfu的试验菌株分别接种于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养基温度（3035）及最短培养基时间下培养。增菌培养基多为澄清液体培养基，与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基变浑浊。固体培养基促生长能力检查：取试验菌液0.1ml（含菌数50100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基上，在相应控制菌检查规定的培养基温度（3035）及最短培养基时间下培养。与对照培养基比较，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致
11、。液体培养基指示能力检查：取不大于100cfu的试验菌株分别接种于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养基温度（3035）及最短培养基时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基中试验菌应生长情况/指示剂反应等应与对照培养基一致。固体培养基指示能力检查：取试验菌液0.1ml（含菌数50100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基上，在相应控制菌检查规定的培养基温度（3035）及最短培养基时间下培养。被检培养基上试验菌的菌落形态特征、菌落颜色及指示剂反应情况应与对照培养基一致。培养基抑制能力检查：取不大于100cfu的试验菌株分别接种于液体被检培养基和对照培养基，取试验菌0.1ml
12、液（不大于100cfu）分别涂布于固体被检培养基和对照培养基，在相应控制菌检查规定的培养基温度（3035）及最长培养基时间下培养。试验菌应不得生长。4.3 控制菌检查用培养基能力测试列表（表7）控制菌检查涉及的21种培养基，特点各异。表格中概述培养基的具体项目，具体操作程序在其后说明。表格7 控制菌检查用培养基适用性检查项目、菌株及判断指标培养基测试菌株测试特征测试指标胆盐乳糖培养基BL大肠埃希菌促生长能力浑浊铜绿假单胞菌浑浊金黄色葡萄球菌抑制能力未见浑浊MUG培养基大肠埃希菌促生长能力浑浊大肠埃希菌指示能力366nm有荧光曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂大肠埃希菌促生长能力回收率乙型副伤寒沙门菌回
13、收率大肠埃希菌指示能力颜色形态同对照乙型副伤寒沙门菌颜色形态同对照乳糖胆盐发酵管培养基大肠埃希菌促生长能力浑浊产气金黄色葡萄球菌抑制能力未见浑浊乳糖发酵培养基大肠埃希菌促生长能力浑浊大肠埃希菌指示能力产气营养肉汤乙型副伤寒沙门菌促生长能力浑浊金黄色葡萄球菌促生长能力浑浊四硫磺酸钠亮绿培养基乙型副伤寒沙门菌促生长能力上清浑浊金黄色葡萄球菌抑制能力上清未见浑浊胆盐硫乳琼脂或沙门志贺属琼脂乙型副伤寒沙门菌指示能力回收率乙型副伤寒沙门菌促生长能力颜色形态同对照溴化十六烷基三甲铵琼脂铜绿假单胞菌促生长能力回收率大肠埃希菌抑制能力不得生长绿脓菌素测定用培养基铜绿假单胞菌促生长能力回收率铜绿假单胞菌指示能力
14、颜色形态同对照亚弚酸盐肉汤培养基金黄色葡萄球菌促生长能力浑浊大肠埃希菌抑制能力未见浑浊卵黄氯化钠琼脂或甘露醇氯化钠琼脂金黄色葡萄球菌促生长能力回收率金黄色葡萄球菌指示能力颜色形态同对照大肠埃希菌抑制能力不得生长梭菌增菌培养基生孢梭菌促生长能力浑浊哥伦比亚琼脂生孢梭菌促生长能力回收率沙氏葡萄糖肉汤白色念球菌促生长能力浑浊沙氏葡萄糖琼脂白色念球菌促生长能力回收率白色念球菌指示能力颜色形态同对照念球菌显色培养基白色念球菌促生长能力回收率白色念球菌指示能力颜色形态同对照大肠埃希菌抑制能力不得生长1%聚山梨酯80玉米琼脂培养物白色念球菌促生长能力回收率白色念球菌指示能力颜色形态同对照4.4各控制菌检查用
15、培养基适用性检查实验操作控制菌检查用培养基较多，特点各不相同。为了避免培养基配制过程出现遗漏，此处特别提示以下几个需要特殊注意到培养基：不可高压灭菌只能加热煮沸的培养基3种：DHL琼脂、SS琼脂和念球菌显色培养基；需要添加试剂的培养基3种：TTB培养基、亚弚酸盐肉汤培养基和哥伦比亚琼脂培养基。以下叙述各培养基适用性检查的具体操作过程：4.4.1胆盐乳糖培养基新鲜配制100ml/瓶的对照胆盐乳糖培养基4瓶，121灭菌15min，备用。分别接种大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及金黄色葡萄球菌各1瓶，接种菌液量1ml(不大于100cfu)，另一瓶不接种菌作为空白对照；被检培养基同法操作，置规定温度培养。培
16、养18h,与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基变浑浊；培养48h，空白培养瓶和接种金黄色葡萄球菌的培养瓶应不得浑浊；4.4.2MUG培养基 新鲜配制50ml/支的对照MUG培养基4瓶，121灭菌15min,备用。取3支，接种大肠埃希菌2支，接种菌液0.2ml(不大于100cfu)，另一支不接种菌作为空白对照，培养5h，在366nm紫外光灯下观察结果；被检培养基同法操作，置规定温度培养。空白培养管应不得浑浊，且366nm处观察无荧光；与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基变浑浊，366nm处应呈荧光。若荧光不明显，则可延长至24h观察。4.4
17、.3 曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB） 新鲜配制对照EMB琼脂培养基，121灭菌15min,冷却至60倾注平皿，35培养箱预培8h后备用。取5个无菌EMB琼脂平板，分别涂布接种大肠埃希菌和乙型副伤寒沙门菌各2皿，接种菌液0.1ml（含菌50100cfu），另一平板不接种菌作为空白对照，涂布均匀后于规定温度倒置培养；被检培养基同法操作。培养18h，被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致；培养24h，空白平板应无菌落生长。4.4.4 麦康凯琼脂培养基 新鲜配制对照麦康凯琼脂培养基121灭菌15min,冷却至60倾注平皿，35培养箱预培8h后备用。取5个无菌麦康凯琼脂平板，分别涂
18、布接种大肠埃希菌和乙型副伤寒沙门菌各2皿，接种菌液0.1ml（含菌50100cfu），另一平板不接种菌作为空白对照，涂布均匀后于规定温度倒置培养；被检培养基同法操作。培养18h，被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致；培养24h，空白平板应无菌落生长。4.4.5乳糖胆盐发酵培养基新鲜配制10ml/支的对照乳糖胆盐发酵培养基，121灭菌15min，备用。取5支，分别接种大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌，各2支，接种菌液量1ml(不大于100cfu)，另一支不接种菌作为空白对照；被检培养基同法操作，置规定温度培养。培养18h,与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液
19、体培养基变色、浑浊，且有导管中应有明显的产气现象；培养24h，空白培养管和接种金黄色葡萄球菌的培养管应不得变色、不得浑浊。4.4.6乳糖发酵培养基新鲜配制10ml/支的对照乳糖发酵培养基，121灭菌15min，备用。取3支，接种大肠埃希菌2支，接种菌液量1ml(不大于100cfu)，另一支不接种菌作为空白对照；被检培养基同法操作，置规定温度培养。培养18h,与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基变色、浑浊，且有导管中应有明显的产气现象；培养24h，空白培养管应不得变色、不得浑浊。4.4.7 营养肉汤培养基新鲜配制100ml/瓶的对照营养肉汤培养基3瓶，121灭菌15m
20、in，备用。分别接种乙型副伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌各1瓶，接种菌液量1ml(不大于100cfu)，另一瓶不接种菌作为空白对照；被检培养基同法操作，置规定温度培养。培养18h,与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基变浑浊；培养48h，空白培养瓶应不得浑浊。4.4.8 四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB）新鲜配制10ml/支的对照四硫磺酸钠亮绿培养基基础，121灭菌15min，备用。临用前，无菌操作加入0.2ml碘试液和0.1ml亮绿试液。取5支，分别接种乙型副伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌各2支，接种菌液1ml(不大于100cfu)，另一支不接种菌作为空白对照；被检培养基同法操
21、作，置规定温度培养。培养18h,与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基上清浑浊；培养24h，空白培养管和接种金黄色葡萄球菌的培养管应不得浑浊。由于TTB中的碳酸钙对浑浊现象观察有影响，因此若浑浊现象不明显，则将各培养物接种至胆盐硫乳琼脂（DHL）或沙门、志贺属琼脂（SS）平板上划线观察TTB培养物生长情况，空白对照和接种金黄色葡萄球菌的培养管划线后应无菌落生长，对照和被检TTB培养基划线接种至琼脂平板后应有菌落生长、且颜色形态一致。4.4.9 胆盐硫乳琼脂培养基（DHL）新鲜配制对照DHL琼脂培养基，加热充分溶解，冷却至60倾注平皿，35培养箱预培8h后备用。取3个无
22、菌DHL琼脂平板，涂布接种乙型副伤寒沙门菌2皿，接种菌液0.1ml（含菌50100cfu），另一平板不接种菌作为空白对照，涂布均匀后于规定温度倒置培养；被检培养基同法操作。培养18h，被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致；培养48h，空白平板应无菌落生长。4.4.10 沙门、志贺属琼脂培养基（SS）新鲜配制对照SS 琼脂培养基，加热充分溶解，冷却至60倾注平皿，35培养箱预培8h后备用。取3个无菌SS 琼脂平板，涂布接种乙型副伤寒沙门菌2皿，接种菌液0.1ml（含菌50100cfu），另一平板不接种菌作为空白对照，涂布均匀后于规定温度倒置培养；被检培养基同法操作。培养1
23、8h，被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致；培养48h，空白平板应无菌落生长。4.4.11溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基基础新鲜配制对照溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，121灭菌15min,冷却至60倾注平皿，35培养箱预培8h后备用。取7个无菌琼脂平板，分别涂布接种铜绿假单胞菌和大肠埃希菌各3皿，接种菌液0.1ml（含菌50100cfu），另一平板不接种菌作为空白对照，涂布均匀后于规定温度倒置培养；被检培养基同法操作。培养18h，被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致；培养24h，空白平板和接种大肠埃希菌的平板应无菌落生长。4.4.12 绿脓菌素测定
24、用培养基（PDP）新鲜配制对照绿脓菌素测定用培养基基础，每升培养基中加入10ml甘油，121灭菌15min,冷却至60倾注平皿，35培养箱预培8h后备用。取3个无菌绿脓菌素测定用琼脂平板，涂布接种铜绿假单胞菌2皿，接种菌液0.1ml（含菌50100cfu），另一平板不接种菌作为空白对照，涂布均匀后于规定温度倒置培养24h；被检培养基同法操作。空白平板应无菌落生长，被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致。4.4.13亚碲酸盐肉汤培养基新鲜配制100ml/瓶的对照营养肉汤培养基3瓶，121灭菌15min，备用。临用前，加入新鲜配制的无菌1%亚碲酸盐0.2ml。分别接种金黄色葡
25、萄球菌和大肠埃希菌各1瓶，接种菌液1ml(不大于100cfu)，另一瓶不接种菌株作为空白对照；被检培养基同法操作，置规定温度培养。培养18h,与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基变黑、变浑浊；培养48h，空白培养瓶和接种大肠埃希菌的培养瓶应不得浑浊。4.4.14 卵黄氯化钠琼脂培养基新鲜配制对照卵黄氯化钠琼脂培养基基础，121灭菌15min,冷却至60，参照2010版中国药典比例无菌操作加入10%氯化钠卵黄液，充分振摇后倾注平皿，35培养箱预培8h后备用。取5个无菌琼脂平板，分别涂布接金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌各2皿，接种菌液0.1ml（含菌50100cfu），另一
26、平板不接种菌作为空白对照，涂布均匀后于规定温度倒置；被检培养基同法操作。培养24h，被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致；培养72h，空白平板和接种大肠埃希菌的平板应无菌落生长。4.4.15 甘露醇氯化钠琼脂培养基新鲜配制对照甘露醇氯化钠琼脂培养基，121灭菌15min,冷却至60倾注平皿，35培养箱预培8h后备用。取5个无菌琼脂平板，分别涂布接种金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌各2皿，接种菌液0.1ml（含菌50100cfu），另一平板不接种菌作为空白对照，涂布均匀后于规定温度倒置；被检培养基同法操作。培养24h，被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致
27、；培养72h，空白平板和接种大肠埃希菌的平板应无菌落生长。4.4.16 梭菌增菌培养基新鲜配制100ml/瓶的对照梭菌增菌培养基2瓶，121灭菌15min，备用。接种生孢梭菌1瓶，接种菌液1ml(不大于100cfu)，另一瓶不接种菌株作为空白对照，置规定温度的厌氧条件培养48h；被检培养基同法操作。空白培养瓶应不得浑浊；与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基变浑浊。4.4.17 哥伦比亚琼脂培养基新鲜配制对照哥伦比亚琼脂培养基，121灭菌15min,冷却至60倾注平皿，35培养箱预培8h后备用。取3个哥伦比亚琼脂平板，涂布接种生孢梭菌2皿，接种菌液0.1ml（含菌50
28、100cfu），另一平板不接种菌作为空白对照，涂布均匀后置规定温度的厌氧条件下倒置培养；被检培养基同法操作。培养48h，空白平板无菌落生长；被检培养基菌落大小、形态特征应与对照培养基上的菌落一致。哥伦比亚琼脂培养基营养丰富，适宜多数需氧菌的生长，为了消除其它杂菌生长对检查结果的影响，可在每升灭菌后培养基中按无菌操作添加含有相当于20mg庆大霉素的硫酸庆大霉素。添加庆大霉素的哥伦比亚琼脂可参照上述方法进行培养基适用性考察。4.4.18 沙氏葡萄糖肉汤培养基新鲜配制100ml/瓶的对照沙氏葡萄糖肉汤培养基2瓶，121灭菌15min，备用。接种白色念球菌1瓶，接种菌液量1ml(不大于100cfu)，
29、另一瓶不接种菌作为空白对照；被检培养基同法操作，置规定温度培养。培养48h,与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基变浑浊；培养72h，空白培养瓶应不得浑浊。4.4.19沙氏葡萄糖琼脂培养基新鲜配制对照沙氏葡萄糖琼脂培养基，121灭菌15min,冷却至60倾注平皿，35培养箱预培8h后备用。取3个沙氏葡萄糖琼脂平板，涂布接种白色念球菌2皿，接种菌液0.1ml（含菌50100cfu），另一平板不接种菌作为空白对照，涂布均匀后于规定温度倒置培养；被检培养基同法操作。培养24h，被检培养基上的菌落大小、形态特征、颜色及气味应与对照培养基上的菌落一致；培养72h，空白平板应无菌
30、落生长。4.4.20念球菌显色培养基新鲜配制对照念球菌显色培养基，加热充分溶解，冷却至60倾注平皿，35培养箱预培8h后备用。念球菌显色平板使用前避光保存，取5个无菌念球菌显色平板，分别涂布接种白色念球菌和大肠埃希菌各2皿，接种菌液0.1ml（含菌50100cfu），另一平板不接种菌作为空白对照，涂布均匀后于规定温度倒置培养；被检培养基同法操作。培养24h，被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致；培养72h，空白平板和接种大肠埃希菌的平板应无菌落生长。4.4.21 1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基新鲜配制对照1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基基础，每升培养基中加入10ml聚山梨酯80，121灭菌15min,冷却至60后，倾注平皿， 35培养箱预培8h后备用。取3个1%聚山梨酯80-玉米琼脂平板，涂布接种白色念球菌2皿，接种菌液0.1ml（含菌50100cfu），另一平板不接种菌作为空白对照，涂布均匀后于规定温度倒置培养；被检培养基同法操作。培养24h，被检培养基菌落大小、形态特征及芽管指示能力应与对照培养基上的菌落一致；培养48h，空白平板应无菌落生长。