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1、循环肿瘤DNA的检测及临床意义肿瘤诊断方法l血清标志物：蛋白类（癌胚抗原，糖类抗原，甲胎蛋白等），核酸类（microRNA, LncRNA）l影像学诊断(超声，CT，MRI，PET，PET-CT)l循环肿瘤细胞（circulating tumor cell , CTC）l循环肿瘤DNA（ circulating tumor DNA，ctDNA）循环肿瘤DNA(ctDNA)l人体血液循环系统中不断流动的携带一定特征（包括突变，缺失，插入，重排，拷贝数异常，甲基化等）来自肿瘤基因组的DNA片段；l来源：1、来自于坏死的肿瘤细胞；2、来自于凋亡的肿瘤细胞；3、循环肿瘤细胞；4、来自于肿瘤细胞分泌的外
2、泌体；l含量低，约占整个循环DNA的1%，甚至只有0.01%。ctDNA发展简史l1948年首次发现人体血液中存在着循环DNA，癌症患者的循环肿瘤DNA则发现于1977年。l1994年发现这些DNA含有癌症的标志性突变，证明其来自于肿瘤。l鉴于肿瘤DNA会流入血液，香港中文大学的卢煜明（Dennis Lo）教授推测胎儿DNA应该也能进入血液。1997年证明孕妇血液中携带着男性胎儿的Y染色体。该发现允许医生们在怀孕初期通过无创方式检测胎儿的性别，甚至筛查唐氏综合症等发育疾病。这是产前诊断领域的一次革命。循环肿瘤DNA的应用l肿瘤的早期诊断；l肿瘤治疗方案确定；l肿瘤疗效观察；l肿瘤预后评估；l肿
3、瘤转移风险分析；l肿瘤复发监测。ctDNA优势l 无创、无损、实时、多次；l 当不能获得肿瘤组织信息时，可以开展“液体活检”；l 假阳性率低，灵敏度高，准确度高，可用于肿瘤的早期诊断；l 能够对肿瘤的演化和适应性改变进行监控；l 能够对肿瘤病人的治疗效果进行实时监控（尤其在追踪肿瘤转归、转移和复发等方面），并进行个性化的治疗方案指导（如个性化靶向药物用药，个性化化疗等）。 ctDNA如何发挥诊断、监测、预后评估的功能？循环DNA水平变化循环DNA基因修饰变异循环DNA完整性点突变杂合性缺失微卫星不稳定性超甲基化 研究热点近10年ctDNA相关发表文章数（pubmed数据库）NEJM：4篇PNA
4、S：7篇JAMA：1篇Sci Transl Med：6篇Cancer research:12篇Clin Cancer Res:28篇l 利用数字PCR检测640例不同癌症病人的血浆ctDNA，在超过75%的病人血液中检测到ctDNA，原发癌检出率约为50%。l 在结肠癌，胃癌，胰腺癌，乳腺癌中，ctDNA检出率分别为73%, 57%, 48%, 50% 。ctDNA在不同恶性肿瘤中的检测l 相对于原发癌，ctDNA在转移癌中检出率更高，且分期越高，ctDNA检出率也更高；l 可用于耐药突变的检测；l ctDNA是普遍适用的、敏感和特异的标志物,可用于不同类型癌症患者的临床监测。ctDNA在不同
5、恶性肿瘤中的检测l 乳腺癌病人（尤其在转移性乳腺癌）的血浆cfDNA的完整性显著下调，而血浆cfDNA的浓度显著上调，可作为早期诊断的标志物，具有较好的敏感度和特异性。ctDNA应用于乳腺癌早期诊断l 在30例转移性乳腺癌患者接受系统性治疗的不同时间点测定血液中的ctDNA，CA 15-3，CTC细胞的含量，比较三者之间的敏感度。Comparison of Circulating Tumor DNA, CA 15-3, and Circulating Tumor Cells as Blood-Based Biomarkers.l 相比于CA15-3和循环肿瘤细胞，循环肿瘤DNA具有更高的灵敏度
6、。Comparison of Circulating Biomarkers to Monitor Tumor Dynamics and Predict Survival.l 相对于蛋白类诊断标志CA15-3及血液中的偱环肿瘤细胞，ctDNA在监测肿瘤的动态发展中具有更高的灵敏度。l 血浆中ctDNA的含量与预后密 切相关，含量越高，病人的5年生存率越低（P0.001）l ctDNA含量的增高及CTC数目的增加，病人的预后显著变差，而CA15-3没有预后判断功能。l肝癌病人的血浆中存在两种不同长度的DNA分子：短链DNA分子（180bp ）；l短链DNA分子与ctDNA突变率及拷贝数异常相关，且
7、与ctDNA浓度正相关；l长链DNA分子不携带肿瘤相关ctDNA特征，且与ctDNA浓度负相关。l 监测ctDNA的突变率比监测cfDNA浓度，对胃癌动态发展的监控灵敏度更高。l 利用区域捕获测序技术检测乳腺癌原发瘤及肝脏转移瘤的基因突变情况，并监控血液中ctDNA在治疗过程中的动态变化。l ctDNA在监测肿瘤的动态发展中具有更高的灵敏度和特异性；l ctDNA能比蛋白类标志物CA15-3更早的预测肿瘤动态发展情况。ctDNA检测技术ctDNA检测技术l标本种类：血浆l提取方法：商品化试剂盒l检测方法：PCR、基因测序l 数字PCR将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中
8、包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA模板) ，实现“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后，通过阳性反应器的数目“数出”目标序列的拷贝数。阴性微滴比例推算起始靶分子的绝对量泊松分布一个待分析的PCR反应体系成千上万个独立的PCR反应体系: 靶标分子:有限稀释: 阳性微滴（1）: 阴性微滴（0）泊松分布PCR扩增优点：可绝对定量，灵敏度可达单个核酸分子，检测限低至0.001%；缺点：只能检测已知的突变位点，通量低；ctDNA检测技术l 标记扩增深度测序（TAM-Seq）突变频率检出率可达2%；敏感性和特异性高于97%；成本较低，利于临床应用。l 癌症个体化深度测序 (CAPP-Seq)对肿瘤的ctDNA检测灵敏度高；特异性强；与全外显子测序等相比经济可行。ctDNA检测技术l BEAMing技术结合数字PCR与流式技术；定量分析，灵敏度高；特异的突变可以通过流式细胞仪进行分离筛选。ctDNA临床应用面临的挑战1234l 发展适合临床应用的ctDNA检测技术(快速、精准、低成本)l 个体化的ctDNA标志物l ctDNA在肿瘤个性化精准治疗领域的应用谢 谢