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1、分子生物化学实验 重组质粒的筛选和鉴定 学生姓名李双男 学号20162012049专业农业资源与环境年级、班级2016级所在学院农学院 重组质粒的筛选和鉴定摘要：本实验目的为熟悉互补筛选的原理，并且掌握重组子筛选的方法和重组子鉴定的方法。从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多,本实验采用试剂盒提取重组DNA。采用PCR扩增检测法和琼脂糖凝胶电泳分析进行实验，得出筛选结果并进行分析讨论，提出了对本实验的展望。关键词：重组质粒；PCR；氨苄青霉素；LB培养液0前言为熟悉互补筛选的原理，并且掌握重组子筛选的方法和重组子鉴定的方法。转化体的筛选是利用载体选择性的遗传标记，主要是不同抗生素基因筛选。重组质粒
2、的鉴定常用-互补、质粒酶切、PCR、分子杂交等方法。互补筛选的原理是载体上LacZ的5端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ的合成，不能互补1。由于在含抗生素平板培养基上长出的白斑不一定是期望的重组质粒，所以重组质粒的鉴定。应用PCR扩增检测法，其原理为PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。直接电泳法是利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大的原理。限制性核酸内切酶酶切法是根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）2。是否符合预计的结果。PCR扩增检测法是根据PC
3、R能在模板序列上扩增出预期DNA片断。质粒PCR筛选法将菌落PCR筛选法初步鉴定出的单菌落，接种于含有Amp(Kan)的LB培养基中,37摇菌培养过夜，利用碱裂解法（或试剂盒）进行质粒的小量提取。独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子，是一种环状的双链DNA分子称为质粒(Plasmid) 。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。质粒类型总共分为两种类型，第一种严谨型，这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步3。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；第二种松驰型，这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-20
4、0份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。质粒结构主要有三大要素： 多克隆位点、选择标记、独立的复制单位。从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的:碱裂解法、煮沸裂解、羟基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放法和酸酚法等4。选择哪一种方法主要取决于质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求这几个因素。其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化，本实验采用试剂盒提取重组DNA。载体DNA1实验技术路线外源DNA连接 转化或转导电穿孔或显微注射
5、重组分子真核细胞受体细胞 原核细胞表达扩增或表达2试验方案2.1材料氨苄青霉素（Amp）、LB培养液、PCR反应体系、试剂盒、2.2仪器旋涡混合器，微量移液取样器，离心管，双面离心管架，水浴锅，制冰机，摇床，超净工作台，培养箱。2.3方法2.3.1 PCR扩增检测法（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁使其混合（4）将微量离心管放在离心机上瞬时离心5s（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序进行反应参数2.3.2琼脂糖凝胶电泳分析反应完毕，取5l扩增产物用1琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反
6、应产物及长度。2.3.3 DNA回收纯化（1）使用1TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。（2）在紫外灯下用干净刀片切下目标带琼脂凝胶块，放入一新离心管中。(注意要在长波长（300nm）UV灯下操作，并快速操作，以免损伤DNA。应尽可能多地去除琼脂糖凝胶)（3）加500l溶胶液，50水浴10min，中间翻动，直至胶块完全溶解，降至室温。（4）将溶液加入离心吸附柱中,12000rpm离心30s,弃掉废液。（5）加700l 漂洗液，12000rpm离心30 s, 弃掉废液。（6）加500l 漂洗液，12000rpm离心2min, 弃掉废液。（7） 取出吸附柱，放入一干净离
7、心管中，加30l洗脱缓冲液溶解。（8）1琼脂凝凝胶鉴定，贮存DNA片段。3试验结果 图1.蓝白斑菌落 图2.电泳 如图1是蓝白斑菌落的筛选结果，结果显示有菌落的产生。在5个培养皿中有三个有蓝白斑出现，证明操作过程没有存在太大问题。但是，在涂平板的时候有两个平板可能存在不均匀的情况或者接种的量比较少，所以导致培养皿里没有培养出来任何菌落。如图2第三个和第四个孔所示，我们的样品只出来了一条条带，另一条没有出来，最后分析结果显示可能是因为我们在点样的时候隔壁组的点样孔破裂了，导致我们点样的时候有点飘，所以最终没有跑出条带。从这些实验中可以看出来，我们在操作过程中存在许多不熟练的现象，而且针对样品使用
8、方面也不太了解，对分子这个现在研究很热的领域还是很欠缺，需要在今后的研究生涯中去不断的提高自己。4实验展望在近几年的基因工程技术研究过程中，常用的重组质粒克隆和空质粒细菌的筛选方法有最经典的利用a互补原理的蓝白斑筛选，还有质粒快检法、菌落PCR、菌落原位杂交、插入失活、限制性内切酶酶切反应等等。这些方法或多或少都存在操作繁琐、耗费资金、使用范围很窄、假阳性率高等缺点。因此我们需要研究一种新型的质粒载体 ，可以更简单高效、快捷可靠的筛选细菌重组质粒克隆5。在本实验中，由于操作问题导致电泳只有一条带成功。进一步要加强实验中的操作规范性，提高做实验的效率，提高成功率。我的研究方向是棉花胁迫下的生理机
9、制，参考许多文献将分子生物技术应用于棉花方面的研究6，因此要熟练掌握分子实验的技术，为以后的科研道路上提供基础。参考文献1 陈勇，周光宏，刘红林.猪_2-AR基因重组质粒的快速筛选,生物技术J.2002,12(5):5-6.2 林俊堂,李玉昌,张会勇等.结合PCR扩增快速筛选鉴定重组质粒J.河南师范大学学报(自然科学版),2002,30(3):68-70.3 王丽辉. 前列腺特异性抗原启动子/增强子重组质粒筛选及特异性的体外鉴定D. 苏州大学, 2014.4 孙桦, 李光明, 刘博伟,等. 靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和筛选J. 上海交通大学学报医学版, 2008, 28(2):224-227.5 王玉, 于爱莲, 姜世金,等. 改良菌落PCR法筛选、鉴定DHBV部分核衣壳蛋白基因的重组克隆J. 中国病原生物学杂志, 2012(4):264-268.6 崔颖,王秀娟,高山等.实时荧光定量PCR技术在植物中的应用J.湖北农业科学,2015,54(13):3073-3077.