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1、DB 41/T XXXXXXXX7AA 附录A（规范性）大口黑鲈弹状病毒检测方法A.1原理大口黑鲈弹状病毒病（Micropterus salmoides rhabdovirus，MSRV）主要感染鲈的一种水生动物病毒，死亡率约为50 %70 %。建立检测鲈弹状病毒的多种检测，适用于大口黑鲈弹状病毒的监测。本方法规定了从水生动物检测大口黑鲈弹状病毒的分离和RT-PCR方法，适用于水生动物中大口黑鲈弹状病毒的检测。A.2 试剂与材料A.2.1水：符合GB/T 6682中一级水的规格。A.2.2细胞系：FHM、 EPC。A.2.3 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20 预冷。A.2
2、.4Taq DNA酶：-20 保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。A.2.5dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5 mmol/L。A.2.6RNA酶抑制剂：-20 保存，避免温度剧烈变化。A.2.7逆转录酶：-20 保存，避免温度剧烈变化。A.2.8RT-PCR用引物，浓度为20 mmol/L，序列如下：oPVP141：5-GAWWTCTGTTAAAGTTTTTTTC-3oPVP143：5-TGGATATGTTCTACTTCCACTTCA-3,扩增PRV糖蛋白基因中大小约为400 bp的片段。A.3仪器与设备A.3.1组织研磨器或无菌研钵。A.3.2恒温培养箱。A.3.3倒
3、置荧光显微镜。A.3.4PCR扩增仪。A.3.5水平电泳仪。A.3.6凝胶成像仪。A.3.7普通冰箱和-80 超低温冰箱。A.3.8降温离心机。A.3.9微量移液器。A.3.10二级生物安全柜。A.4样品和靶器官的采集DB 41/T XXXXXXXX8样品包括活的、发病的、濒死的鱼和鱼卵，采样数量按照GB/T 18088规定执行。体长小于4 cm的鱼苗取整条鱼；4 cm6 cm的鱼苗取肾脏在内的所有内脏；体长大于6 cm的鱼取脑、脾和肾。实验室检测条件应符合GB 19489的规定。A.5小样的制备及处理最多以10条鱼为一个小样，每个小样至少取0.5 g组织。对组织称重后，用无菌手术剪刀将其剪碎
4、并研磨成糊状，用细胞培养液1（附录A.1）按照10 mL/g比例将研磨后的组织重悬（将此组织液称为1:10稀释度）。4 孵育过夜。4 、12000 r/min离心15 min，取上清用于后续实验。A.6 诊断方法A.6.1病毒分离A.6.1.1单层细胞的制备用胰酶EDTA消化液消化EPC或FHM细胞后，用细胞培养液2重悬细胞，加入细胞培养板，25 培养，使细胞生长至单层。A.6.1.2接种细胞将以上三个不同稀释度的组织上清液分别接种至新鲜的EPC或BF-2单层细胞，每个稀释度至少3孔，每孔中组织上清液与细胞维持液的比例为1:10。同时，设立阳性对照和空白对照，阳性对照孔中接种PRV参考株，空白
5、对照孔中接种相同体积细胞培养液2。25 培养，倒置显微镜下连续观察7 d10 d。A.6.1.3盲传首次接种细胞7 d10 d后未出现CPE，需进一步盲传。将细胞培养物反复冻融3次，收集至无菌离心管。4 、7000 r/min离心15 min或用直径0.45 nm滤器滤除细胞碎片，取上清。用细胞培养液2将上清液稀释至1:10和1:100，将上清液、1:10和1:100稀释液接种于新鲜的EPC或BF-2单层细胞，至少3孔，组织上清液接种量与孔内细胞培养液比例为1:10。同时，设立阳性对照和空白对照。25 培养，倒置显微镜下连续观察7 d10 d。A.6.1.4结果判定PRV 感染 EPC 细胞后
6、，可出现典型 CPE，表现为局部细胞变圆、皱缩和裂解，以此为中心周围细胞的病变范围扩大，形成明显空斑，最终细胞呈拉网状直至全部悬浮脱落。若样品首次接种细胞或盲传后细胞出现典型 CPE，则判定为阳性。若样品盲传后细胞仍未观察到 CPE，则判定为阴性。若阳性对照或空白对照不成立，换用敏感细胞，需重新实验。A.6.2逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）A.6.2.1对照设立从核酸抽提起，每步实验均需要设立阳性对照、阴性对照和空白对照。用PRV的病毒悬液作为阳性对照，用正常细胞悬液作为阴性对照，以DEPC水代替样品作为空白对照。A.6.2.2核酸抽提DB 41/T XXXXXXXX9取细胞培养物250
7、 L至无RNA酶的1.5 mL离心管，加入600 L Trizol溶液，剧烈震荡混匀后，室温放置5 min。加200 L氯仿，盖紧盖子，剧烈摇动15 s，室温放置3 min。4 、12 000 r/min离心15 min。吸取上清至新的无RNA酶离心管，加入500 L预冷的异丙醇，上下翻转混匀，室温放置10 min。4 、12 000 r/min离心15 min。缓慢弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，将液体去除。加入1 000 L预冷的75 %乙醇缓慢倒转洗涤沉淀。4 、12000 r/min离心15 min，弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥沉淀5 min10 min。加入20 L DE
8、PC水，4000 r/min离心5 s，室温溶解10 min。-80 保存备用。在实验过程中，可采用同等效果的商业化RNA抽提试剂盒代替以上方法。A.6.2.3反应体系10PCR buffer 5L，25 mmol/L MgCl2 5L，2.5 mmol/L dNTPs 4 L，20 mol/L引物F1和R1各 2.5L，5 U/L DNA聚合酶 0.5L，5 U/L逆转录酶 1L，40 U/L RNA酶抑制剂 1 L，总RNA 5L，加DEPC水至总体系50L。每个反应体系设置两个平行。A.6.2.4反应条件50 逆转录30 min；95 预变性5 min；95 变性30 s，45 退火25
9、 s，72 延伸20 s，共40个循环；72 再延伸10 min；4 保存。A.6.2.5琼脂糖电泳用TBE电泳缓冲液配制浓度为1.5 %的琼脂糖（含0.5 g/mL溴化乙锭凝胶板）。将其放入水平电泳槽，使电泳缓冲液没过胶面。将5L PCR产物与1L 6上样缓冲液（见附录A.7）混匀后加入样品孔，5 V/cm电泳约40 min，当溴酚蓝到达凝胶板3/4处时停止，置于凝胶成像仪观察结果。电泳时，设立DNA标准分子量对照。A.6.2.6测序对RT-PCR扩增产物进行基因测序，并将测序结在Genbank进行比对分析。A.6.2.7结果判定阳性对照可扩增出一条大小约为 400 bp 的特异性条带，阴性
10、对照和空白对照无大小为 400 bp的条带。若阳性对照、阴性对照或空白对照不成立，则需要重新实验。若被检样品扩增出大小约为 400 bp 的特异性条带，且基因测序结果正确，则判定为阳性。若被检样品未扩增出大小约为 400 bp 的条带，则判定为阴性。A.7综合判定A.7.1满足以下任何一条均可判定为MSRV可疑：样品为MSRV易感鱼类且具有典型临床症状。样品为MSRV易感鱼类且具有典型、明显的组织病理变化。病毒分离方法可见明显细胞病变。RT-PCR方法检测结果为阳性。A.7.2在A.7.1的基础上，满足以下任何一条均可判定为MSRV阳性：病毒分离出现典型、明显细胞病变，且用 RT-PCR 方法检测细胞培养物为阳性。RT-PCR 方法检测为阳性。