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1、昆明医学院第二附属医院检验科,1,昆明医学院第二附属医院检验科 杨红英,酶免疫技术,昆明医学院第二附属医院检验科,2,放射免疫技术,发光免疫技术,酶免疫技术,三大经典标记技术,酶免疫技术-三大经典标记技术之一,三大经典标记技术：,昆明医学院第二附属医院检验科,3,主要试剂: 酶标记的抗体或抗原酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性,抗原抗体反应的特异性,+,酶高效催化反应的专一性,酶免疫技术的原理及特点,昆明医学院第二附属医院检验科,4,酶免疫技术的原理,酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,昆明医学院第二附属医院检验科,
2、5,特点,抗原抗体反应的特异性与酶高效催化反应的专一性 相结合灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联，衍生出适用范围更广的新方法。,昆明医学院第二附属医院检验科,6,酶及作为标记酶的要求,活性高：低浓度底物，高催化反应有与抗原、抗体共价结合的集团标记后不影响稳定显色信号易于判断和测量底物易于配制保存且对人体无害酶及底物价廉,昆明医学院第二附属医院检验科,7,常用酶-辣根过氧化物酶（HRP）,来源于植物特点：糖蛋白（主酶）和亚铁血红素（辅基）的结合物纯度用纯度数（RZ）表示，与酶的活性无关，酶活性以单位U表示。酶变性后RZ不变但活性降
3、低。优势：容易获得、价廉、稳定常用于ELISA,昆明医学院第二附属医院检验科,8,常用酶-碱性磷酸酶（AP）,来源于大肠杆菌或小牛肠黏膜，二者的理化性质不同。特点：敏感性高于HRP，本底低。不容易获得高纯度制剂，稳定性低、价格高。多用于均相酶免疫测定,昆明医学院第二附属医院检验科,9,HRP的常见底物,邻苯二胺 OPD,四甲基联苯胺 TMB,5-氨基水杨酸5-ASA,2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS,常用底物,昆明医学院第二附属医院检验科,10,常用底物,邻苯二胺 OPD： OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。缺陷：不稳定，致癌。,昆
4、明医学院第二附属医院检验科,11,常用底物,四甲基联苯胺 TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm 。优势：稳定，无致癌性， ELISA中应用最广泛的底物。需注意在溶液中不稳定,昆明医学院第二附属医院检验科,12,酶免疫技术的核心组成部分,酶结合物（conjugate）酶标记物,通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物,酶标记抗体或抗原,昆明医学院第二附属医院检验科,13,抗原要求纯度高，抗原性完整,抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。,制备方法要求,酶标记抗体或抗原,昆明医学院第二附属医院检验科,14,制备方法要求,技术
5、方法简单、产率高，重复性好,标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性,酶标记物稳定 ，不形成聚合物,酶标记抗体或抗原,昆明医学院第二附属医院检验科,15,制备方法,戊二醛交联法,酶标记抗体或抗原,改良过碘酸钠法,昆明医学院第二附属医院检验科,16,戊二醛交联法,戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。,昆明医学院第二附属医院检验科,17,改良过碘酸钠法,过碘酸钠氧化酶的多糖羟基为醛基，醛基+抗体蛋白中的游离氨基Schiff 碱，Schiff 碱 + 硼氢化钠稳定的酶标志物常用于HRP标记抗体或抗原,昆明医
6、学院第二附属医院检验科,18,纯化及鉴定,标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度,常用的纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯,酶标记抗体或抗原,昆明医学院第二附属医院检验科,19,固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法,固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面,固相载体,昆明医学院第二附属医院检验科,20,要求,结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性 利于反应充
7、分进行 固相方法简便易行，快速经济,种类,塑料制品 微颗粒膜载体,固相载体,昆明医学院第二附属医院检验科,21,将抗原或抗体结合于固相载体,用1%5%的牛血清白蛋白或5%20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附,包被coating,封闭blocking,包被与封闭,昆明医学院第二附属医院检验科,22,酶免疫技术分类,昆明医学院第二附属医院检验科,23,酶免疫技术,酶免疫组化,酶免疫测定,均 相,非均相,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,组织切片或其它标本中抗原的定位,液体标本中抗原或抗体的定性和定量,昆明医学院第二附属医院检验科,24,用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定,
8、酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。,原理,均相酶免疫测定,昆明医学院第二附属医院检验科,25,最具代表性的两种技术,酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutiplied immunoassay technique,克隆酶供体免疫分析 CEDIAcloned enzyme donor immunoassay,均相酶免疫测定,昆明医学院第二附属医院检验科,26,EMIT示意图(enzyme-multiplied immunoassay technique）,昆明医学院第二附属医院检验科,2
9、7,CEDIA示意图（cloned enzyme donor immunoassay）,昆明医学院第二附属医院检验科,28,分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免疫测定,与均相不同之处,需分离游离与结合的酶标记物,非均相酶免疫测定,昆明医学院第二附属医院检验科,29,酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assy，ELISA）,昆明医学院第二附属医院检验科,30,底物显色定性或定量的分析,原理,包被,反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体,洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物
10、与未结合的分离,1,2,3,4,一、基本原理,昆明医学院第二附属医院检验科,31,固相的抗原或抗体,酶标记物（酶结合物）,酶反应的底物,三个必要试剂,二、方法类型及反应原理,昆明医学院第二附属医院检验科,32,双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 常用于检测乙型肝炎表面抗原和e抗原等,ELISA检测抗原的方法,昆明医学院第二附属医院检验科,33,昆明医学院第二附属医院检验科,34,1、已知抗体包 被于载体表面,3、加酶标抗体 与抗原结合,4、加酶作用的底物产生颜色,2、加待检物抗原与抗体结合,4、加酶作用的底物 不产生
11、颜色,双抗体夹心法测抗原,1、已知抗体包 被于载体表面,2、加待检物无抗 原与抗体结合,3、加酶标抗体 无抗原结合,+,-,Y,Y,E,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,昆明医学院第二附属医院检验科,35,竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。,ELISA检测抗原的方法,昆明医学院第二附属医院检验科,36,昆明医学院第二附属医院检验科,37,竞争法测抗原,+,-,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,E,Y,2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合,3、加酶作用的底物不显色或显色弱,3、加酶作用的底物显色
12、,1、已知抗体包被于载体表面,1、已知抗体包被于载体表面,2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合,昆明医学院第二附属医院检验科,38,特 点,应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）酶标记抗原与样品中的非标记抗原具有相同的与固相抗体结合的能力反应体系中固相抗体和酶标抗原是固定限量，且前者的结合位点少于酶标记和非标记抗原的分子数量和判读结果：结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原的量与样品中非标记抗原的浓度成反比,昆明医学院第二附属医院检验科,39,1、间接法方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点 一种酶标抗抗体检测各种与
13、抗原相应的抗体应用 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定,ELISA检测抗体的方法,昆明医学院第二附属医院检验科,40,昆明医学院第二附属医院检验科,41,1、已知抗原吸附于载体表面,2、加待检物无抗体与抗原结合,3、加酶标抗Ig与抗体结合,4、加酶作用的底物产生颜色,1、已知抗体吸附于载体表面,2、加待检物有抗体与抗原结合,3、加酶标的抗Ig抗体,4、加酶作用的底物不产生颜色,间接法测抗体,-,Y,E,Y,+,昆明医学院第二附属医院检验科,42,2、双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体,ELISA检测抗体的方法,昆明医学院第二附属医院检验科
14、,43,3、竞争法原理：抗原+固相载体 固相抗原+待测标本/酶标抗体 待测标本/酶标抗体竞争与固相抗原结合 显色 颜色深浅与待测物含量成反比 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测,ELISA检测抗体的方法,昆明医学院第二附属医院检验科,44,4、捕获法 应用： 病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体,ELISA检测抗体的方法,昆明医学院第二附属医院检验科,45,捕获法,原理：抗人IgM链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体 底物显色,昆明医学院第二附属医院
15、检验科,46,捕获法原理,+,-,1、固相化抗人IgM,1、固相化抗人IgM,2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合,3、加特异性抗原，与特异性抗体结合,4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色,2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合,3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合,4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色,昆明医学院第二附属医院检验科,47,ELISA应用中的质量控制,昆明医学院第二附属医院检验科,48,酶标仪,滤光片波长精度检查 用紫外可见光分光光度计对滤光片进行扫描，检测值与标定值之差即滤光片波长精度，应1.0nm 。通道差检测：取一只酶标板小孔，以
16、酶标板架做载体，内加200l甲基橙溶液，吸光度值调至0.500A左右，先后置于8个通道的相应位置，蒸溜水调零，于490nm 处连续测3次，观察其不同通道的检测器测量结果的一致性，可用极差值来表示，应0.015。孔间差的测量：选择同一厂家同一批号酶标板分别加入200l甲基橙溶液，先后置于同一通道，蒸溜水调零，于490nm 处检测，其误差大小用士1.96S衡量， 0.005A。,昆明医学院第二附属医院检验科,49,标本的采集和保存,血清：避免溶血，避免长菌。标本在冰箱中保存时间过长，易导至血清中IgG聚合，使用间接法的试剂盒可使本底加深。一般血清置4冰箱5天内完成测试。如需保存1周以上，则要-2O
17、冰冻保存，融解时应上下颠倒，充分混匀，避免产生气泡，离心后用。ELISA的灵敏度在ng/ml和pg/ml水平上，要尽力避免标本间的相互交叉污染，尤其不应与生化试验用同一管标本。,昆明医学院第二附属医院检验科,50,分析中质控,加样 样品加在正确的位置。量需准确。滴瓶滴加试剂时加样姿势应一致。.温育 温育的方法一般采用水浴，可将酶标板置于水浴箱的隔板上，水要浸至板条1/3处，使反应液温度迅速达到平衡。为避免蒸发，板上应加盖或封条。如在温箱中温育，要使用湿盒。所有酶标板均不可叠加放置。,昆明医学院第二附属医院检验科,51,分析中质控,.洗涤 对于准确判断结果十分重要，是决定实验成败的关键，通过洗涤
18、可分离游离的和结合的酶标记物，同时洗涤也可将非特异吸附的蛋白质干扰以及血细胞、细菌中的酶干扰清除掉。 手工洗涤 洗板机洗板。显色 显色是HRP催化底物的一步呈色反应，需要一定的时间和温度，一定要按照说明书规定的时间、温度(一般为3710-15分钟)恒定反应后用酸终止。,昆明医学院第二附属医院检验科,52,酶标仪判读结果,显色反应用酸终止后应立即比色。显色系统有OPD和TMB特性不同。 OPD灵敏度高，比色方便，缺点是配成应用液后稳定性差。TMB的反应用酸不易终止，所以必须尽快比色，以免影响结果。 使用双波长的优点是可以消除反应板条的划痕、手印等的干扰。,昆明医学院第二附属医院检验科,53,报告
19、方式,定性试验:国内外为了便于统一计算，一律按S/C.O方式报告。 定量测定:用已知量的标准品作一系列稀释，做ELISA测定，绘制标准曲线，结果以绝对量或单位表示之。ELTSA的标准曲线每次都要和待测样品做在同一块板上。ELISA的定量标准曲线只有较窄的浓度范围内呈线性，不容易要得到精确的结果。,昆明医学院第二附属医院检验科,54,分析后质控,实验结束后，必须对实验结果作出可靠性和准确性或可比性的判断。通常通过室内质控获取可靠性的保证，通过室间质评取得准确性或可比性的保证。ETISA有定性、定量试验两种，质控手段也有区别。,昆明医学院第二附属医院检验科,55,定性试验,ELlSA定性试验的临床
20、意义在于判断有无病原体感染，与检出量无关。因此，要保证试验的灵敏度和特异性，通常的质控方法用临界值血清界定法。将试剂盒所设的阴阳性对照为内对照，作为指示反应;另设临界值血清、正常人阴性血清和高值阳性作为外对照，与样品同时检测，每块酶标板均应设置。临界值血清S/C.O1，高值阳性对照S/C.O10，正常人阴性对照A值在0.05-0.06之间，质控合格。有一项失控均应重测样品，如临界值血清失控(临界值血清控制灵敏度)重做A值在C.O附近的样品。阳性对照失控应重做阴性样品;阴性对照失控，应重做阳性标本。,昆明医学院第二附属医院检验科,56,定量试验,可根据具体情况选择前述质控图及其他方式进行质量控制
21、。高值质控物失控应重做强阳性样本，低值质控物失控应重做弱阳性样品，试剂盒批号更改应重新制作标准曲线及质控图，质控物批号改变也应重做质控图,昆明医学院第二附属医院检验科,57,本底过高问题的分析和处理,本底过高： 当空白OD值0.1，试剂空白应该不加酶而加了酶：参考阴性OD值；如其整个反应板均有浅颜色，本底0.1 时应作如下处理：1）增加洗板次数；2）缩短孵育时间；3）缩短显色时间；4）请试剂厂家协助调整试剂的生产工艺。,昆明医学院第二附属医院检验科,58,质控血清的制备:,室内质控血清可以参考国内、国际权威定值标准品自己制备其步骤为:收集阳性血清(无明显溶血、黄疽、脂肪血或污染血清)，累积到一
22、定数量(够本室使用 3一6个月的量); 传染性病毒阳性血清需经56、lO小时灭活后使用; 过滤去除纤维沉降物; 用正常人血清或10%小牛血清PBS溶液稀释; 测定值与定值参考品进行对比、求值，一般选择在C.O附近的阳性值; 分装小瓶(每日用量)，加盖、贴签，-2O冻存备用。无质控血清的室内质控:定性试验可以用试剂盒内的阴阳性对照(内对照)作参考，阴性对照0.05，空白对照0.03，阳性对照0.80，阳性A值-阴性A值08为试验合格定量试验可以用试剂盒提供的标准系列作参考，每板标准品A值应在2S范围内。,昆明医学院第二附属医院检验科,59,影响免疫试验的因素,一、标准品与参考品 免疫检验的标准品
23、与参考品是用于建立标准曲线所必须的物质，标准品与被测定物应有相同的特性。二、抗原、抗体活性与效价的影响 失活或效价降低的主要原因：A、储存时间或稀释后放置过久。B、反复冻融。三、标记抗体（或）抗原的脱落及失活 免疫检验的标记物如辣根过氧化物酶、碘（131I）胶体金等在储存过程中可受多种影响而使结合物分解或脱落， 造成免疫反应减弱出现假阴性结果。四、温度与反应时间的影响 抗原与抗体反应达到完全平衡，依赖于温度与时间，并与抗原抗体反应的质量（亲和力）直接相关。,昆明医学院第二附属医院检验科,60,酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫学检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性并通过显色判断结果,小 结,昆明医学院第二附属医院检验科,61,酶免疫技术,酶免疫组织化学-多用于病理酶免疫测定-均相-标记酶活性被激活或抑制改变-测定活性改变知被检物含量 非均相液相、固相 固相检测抗原双抗体夹心法、竞争法 检测抗体：间接法（、）双抗原夹心法（）竞争法（和）捕获法（）,昆明医学院第二附属医院检验科,62,1酶免疫技术的要点？2酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？3竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？4常用的底物有哪几类？特点？5常用的酶有哪几类？特点？,思考题,