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1、生物化学设计性实验报告阿托伐他汀钙片对小鼠调脂作用的观察 1.实验目的 观察临床常用调脂药物阿托伐他汀钙片对小鼠血清中脂类物质调节作用。 2.实验原理 本品为HMG-CoA还原酶选择性抑制剂，通过抑制HMG-CoA还原酶和胆固醇在肝脏的生物合成而降低血浆胆固醇和脂蛋白水平，并能通过增加肝细胞表面低密度脂蛋白(LDL)受体数目而增加LDL的摄取和分解代谢，因此对高密度脂蛋白(HDL)也有一定的调节作用。 对小鼠使用阿托伐他汀钙片，一段时间后测定血清中的总胆固醇含量和高密度脂蛋白的含量，并设置对照组，来观察此药物对脂类物质的调节作用 2+ 空腹血浆脂蛋白主要为低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(
2、HDL)，PAT-Mg具有选择性沉淀载脂蛋白为apoB的脂蛋白LDL，则上清液为HDL,HDL以HDL-C表示含量。 胆固醇酯+HO -胆固醇酯酶-胆固醇+RCOOH 2胆固醇+O -胆固醇氧化酶-?4-胆甾烯酮+HO 222HO+4AA+ESPAS-过氧化氢酶-醌亚胺染料+ HO 222血清胆固醇经如下反应，可以生成红色醌亚胺: 胆固醇酯+HO -胆固醇酯酶-游离胆固醇+脂肪酸 2游离胆固醇+O-胆固醇氧化酶-胆甾烯酮+HO 222HO+4氨基安替比林+4氯酚-过氧化物酶-苯醌亚胺(红色) 223.实验步骤 3.1取两只小鼠于鼠笼中，做好标记，对药物组小鼠灌胃适量阿托伐他汀钙片溶液(用药量参
3、照人体用量，按照小鼠重量进行比例换算，并溶解于适量生理盐水中，生理盐水不宜过多)，灌胃后等待一个半小时，让小鼠将药物充分吸收并起作用。 3.2对两只小鼠分别进行摘除眼球放血处理，并将血液放置于抗凝瓶中，后转至离心管中以3000r/min离心5min。 3.3取上清液即为血清，测量血清高密度脂蛋白和总胆固醇含量。 ?血清高密度脂蛋白(HDL)测定 按下表加样操作: 空白管B 标准管S 对照实验组T1 药物实验组T2 蒸馏水/L 200 血清/L 200 200 6.方向角：指北或指南方向线与目标方向线所成的小于90的水平角，叫做方向角。如图4，OA、OB、OC、OD的方向角分别是；北偏东30，南
4、偏东45(东南方向)、南偏西为60，北偏西60。标准液/L 200 4、初步学会应用加减法解决生活中简单问题，感受数学在日常生活中的作用,感受加减法与日常生活的密切联系,同时获得一些初步的数学活动经验，发展解决问题和运用数学进行思考的能力。沉淀剂/L 200 200 200 200 混匀，置室温10min，再以3000r/min离心15min,吸取上清液 上清液/L 150 150 150 150 工作液/L 1500 1500 1500 1500 混匀，置于37?保温10min,以空白管调零，在546nm波长下比色读取各管A值。 ?血清总胆固醇含量测定 取洁净酶标板条一条，标号(1-7)后按
5、下表加入试剂 对照实验组药物实验组 空白孔(1) 校准孔(2-3) 测定孔(4-5) 测定孔(6-7) 校准液/ul 2 初中阶段，我们只学习直角三角形中，A是锐角的正切；血清/ul 2 2 生理盐水/ul 2 酶工作液/ul 200 200 200 200 摇匀，置生化保温箱37?15min。 176.186.24期末总复习在500nm波长处，以空白孔调零，读取其余各孔的吸光度A。 二、学生基本情况分析：4.实验结果 (4)面积公式:(hc为C边上的高);? 血清高密度脂蛋白(HDL)测定 A=0.887 A对照实验组=0.409 A药物实验组=0.512 S则对照实验组HDL-C含量(mm
6、ol/L)=A/A1.29=0.409/0.8871.29=0.585mmol/L TS则药物实验组HDL-C含量(mmol/L)=A/A1.29=0.512/0.8871.29=0.745mmol/L TS?血清总胆固醇含量测定 (2)如圆中有直径的条件,可作出直径上的圆周角.（直径添线成直角）As平均值=0.173 A对照实验组平均值=0.407 A药物实验组平均值=0.249 则对照实验组C胆固醇(mmol/L)=(A对照平均值/As)校准物浓度=7.434mmol/L 则药物实验组C胆固醇(mmol/L)=(A药物平均值/As)校准物浓度=4.548mmol/L 5.实验结论 弓形：弦
7、及所对的弧组成的图形叫做弓形。从实验结果中可以看出灌胃阿托伐他汀钙片一个半小时后即可使血清中高密度脂蛋白含量明显升高，使血清中总胆固醇含量明显降低，可见该药物对调制作用起较好的效果。 6.实验讨论 (1)随着生活质量不断提高，心脑血管疾病已成为危害人类身体健康的第一大类疾病，受到极大程度的重视。血清总胆固醇升高是动脉粥样硬化的主要危险因素之一，总胆固醇包括极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)三种，在正常情况下，LDL-C被肝细胞或肝外组织细胞在受体的介导下内吞入胞内而降解掉，但是当LDL-C的含量升高时，LDL-C在动脉壁堆积
8、，引起动脉粥样硬化，因此LDL-C与动脉硬化引起的心脑血管疾病呈正相关，被称为“危险因子”;HDL的功能是将肝外组织的胆固醇逆向转运至肝脏进行代谢，因此HDL-C的含量升高，可以从动脉壁清除多余胆固醇，与动脉硬化引起的心脑血管疾病呈负相关，被称为“防御因子”，因此鉴于HDL-C和LDL-C升高所起的作用不同，分别测定LDL-C和HDL-C的含量在临床诊断与治疗中就具有重要意义。 (2)与乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)相比，高密度脂蛋白(HDL)是密度最大的脂蛋白(d=1.063,1.210 kg/L)。其组分中蛋白质(Pro)、磷脂(PL)、胆固醇(cho
9、l)和甘油三酯(TG)各约占50%、25%、20%和5%。HDL中Pro主要是载脂蛋白(apo)AI和AII;chol占总胆固醇(TC)的25%,35%，酯化胆固醇(CE)和游离胆固醇(FC)之比约为3?1。HDL可通过酶和受体的作用，将四周组织的chol移至肝脏降解处理，同时抑制细胞结合和摄取LDL-C，阻止chol在动脉壁的沉积，故HDL被以为是AS的预防因子。 (3)化学沉淀法:常用的沉淀剂为多阴离子，如磷钨酸(PTA)、DS、肝素(Hep)或非离子多聚体如聚乙二醇(PEG)与某些两价阳离子(如Mg2+、Ca2+、Mn2+)适用能使除HDL外含apoB的脂蛋白都沉淀。沉淀形成的机制还不十
10、分清楚。HDL中chol多用酶法(CHOD-PAP)测定。此类方法操纵简单，不需昂贵设备且用度较低，适用于普通实验室。被NCEP推荐为常规方法。早期的沉淀法如用Hep-Mn2+法，易受高TG干扰，使沉淀后的上清呈浑浊状，且Mn2+干扰酶法测定chol，故目前已基本不用。只是CDC-NHLBI(国立心肺血液学研究所)现存的有关HDL-C与CHD风险的流行病与临床数据库源于此法，故NCEP建议予以保存。(4)电泳法:在一定电场条件下，由于各种脂蛋白的分子大小及其在缓冲溶液中所带电荷数的不同，故在支持介质上迁移率亦不同。较小的HDL分子朝阳极有较高的迁移率，可将HDL与VLDL、LDL区分开。Hel
11、ena公司已开发可供REP快速全自动电泳仪使用的HDL-C检测试剂盒，其原理是:血清145.286.3加与减（三）2 P81-83(1 l)经琼脂糖凝胶电泳(400V，15分钟)后，将chol基质试剂均匀展在凝胶表面，孵育一段时间(10分钟)后用10%冰醋酸固定，然后将凝胶烤干。570 nm波长下自动扫描即可确定HDL-C百分含量。同时将血清TC值输进，则可求得血清HDL-C值。此法与PTA-Mg2+法有较好相关性，可用于高TG标本检测，也常用于评价各种化学沉淀法沉淀是否完全等，目前多用于临床研究。 3.规律：利用特殊角的三角函数值表，可以看出，(1)当角度在090间变化时，正弦值、正切值随着
12、角度的增大(或减小)而增大(或减小)；余弦值随着角度的增大(或减小)而减小(或增大)。(2)0sin1，0cos1。(5)该品口服吸收良好，因经肝内广泛首关代谢，绝对生物利用度较低，大约为12%，该品在肝脏经细胞色素P4503A4代谢为多种活性代谢物。阿托伐他汀的平均血浆半衰期大约为14小时，但由于其活性代谢物的影响，实际对HMG-CoA还原酶抑制作用的半衰期为20,30小时。该品蛋白结合率为98%，大部分以代谢物的形式经胆汁排出。 (6)高密度之蛋白测定中应当注意?沉淀后上清液必须清澈，上清液浑浊时，不得分析测定，应以生理盐水1:1稀释后重新离心沉淀，结果值乘以2.?试剂不使用时应注意及时加盖，低温避光保存。 (7)血清总胆固醇含量测定时应注意?为防止污染，所有吸管、试管需清洁干燥。?校准液吸取后应立即盖好，防止溶液挥发浓度不准。