1、兼顾速度与可靠性兼顾速度与可靠性 Eppendorf PCREppendorf PCR系统系统 20 Years of PCRKary Mullis PCR只是一个概念，所发生的只是一个概念，所发生的奇迹是：奇迹是：PCR概念变成了可操概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概的技术，后者又上升成为新的概念。念。它最大的特点就是能不断推出新形它最大的特点就是能不断推出新形式。式。摘自Making PCR:A Story of Biotechnology by Paul RabinowTTTTTAAACCCCCAAAATTTCCCCCCTA
2、AGG GGGGGGGGGDenaturation 94CAnnealing55CElongation72CPolPolPCR5353Separation of strandsAnnealing of primerElongation by polymerasePCR后分析结果后分析结果PCR products in different sizes3kb500bp300bp为什么终点法定量不准确为什么终点法定量不准确?CtEndpoints同一样品尽管平台期同一样品尽管平台期DNA拷贝数波动很大，拷贝数波动很大，CT值却是相对固定的。值却是相对固定的。典型的典型的PCR四阶段四阶段半对数图谱线
3、性图谱平台期典型的典型的PCR四阶段四阶段线性增长期基线期指数增长期PCR理论方程理论方程lg DNA循环数线性期线性期平台期平台期y=x(1+e)n指数期指数期N=N0 x(1+e)nN:产物分子数N0:起始分子数e：扩增效率n:循环次数 PCR理论方程只在指数期成立理论方程只在指数期成立PCR指数增长期的规律 PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：Yn=X(1+E)n 0E1 其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，X为n-1个周期后PCR产物的分子数量。等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳
4、定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增.定量定量PCR测定的测定点为测定的测定点为PCR扩增的指数扩增期扩增的指数扩增期;而定性而定性PCR测定的测定点则多为测定的测定点则多为PCR扩增的平台期扩增的平台期为什么终点法定量不准确为什么终点法定量不准确?CtEndpoints同一样品尽管平台期同一样品尽管平台期DNA拷贝数波动很大，拷贝数波动很大，CT值却是相对固定的。值却是相对固定的。Ct(Threshold Cycle)-The cycle number where the reaction fluorescence exceeds background fluorescence.Cycle#
5、FluorescenceCtCtCtThresholdThreshold-The peak of background fluorescence,as defined by the platform or the user.Background FluorescenceAmplification Plot定量分析原理 Yct=X(1+E)n=2n X Ect=1CT值的定义是值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。CT值与起始模板浓度成负相关关系负相关关系,不同不同CT值的值的模板起始浓度相差2n倍,n为CT间差值间差值为什么为什么CT值值 起始起
6、始DNA浓度浓度?当循环次数n=CT值时：RCT=RB+X0(1+e)CT Rs lg(RCT-RB)=lg X0+CT lg(1+e)+lg RsCT lg(1+e)=-lg X0+lg(RCT-RB)lg Rs即 CT=-k lg X0+b（线性方程）Rn=RB+X0(1+e)n Rs定量PCR的实质模板定量模板定量找到找到PCR的指数增长期的指数增长期定量数据归一化定量数据归一化real-time PCR应用范围科研的主要工具科研的主要工具mRNA与基因表达的研究DNA拷贝数的检测单核苷酸多态性（SNPs）的测定DNA 芯片结果认证医学方面应用前景更是令人鼓舞医学方面应用前景更是令人鼓舞
7、极微量的基因表达定量病原体检测绝对定量Unknown通常用标准品作为外参照外参照制作标准曲线.注意保持与目的基因的同源性标准曲线的制作标准曲线的制作什么是阈值什么是阈值基线阈 值标准偏差基线信号的标准偏差 x 10CT值基 线阈 值基线基线阈值阈值CT值值 I3,125I6,250I12,500I25,000I50,000I100,000Absolute amount.(copies)EXACT scale20-19-18-17-16-15-CT A B CCT161819Absolute amount50,000 copies12,500 copies6,250 copiesSample A
8、Sample BSample C标准曲线方法标准曲线方法通过通过CT值测定起始值测定起始DNA量量浓度增加浓度增加1倍，倍，CT值减小值减小1个单位个单位浓度增加浓度增加10倍，倍，CT值减小值减小3.3个单位个单位相对定量 CtSample CtNon treated sampleHousekeeping Gene Ct Ct Ct2-Ct=Change in Expression LevelGene of Interest相对定量 Ct=9.70Ct=9.70 Ct=-1.7Ct=-1.7 Ct=target-refCt=target-ref Ct=target-refCt=target-
9、refDifference=Difference=Ct-Ct-CtCt=CtCt=9.70-(-1.7)=9.70-(-1.7)=11.40=11.40IL1-bconIL1-bconRPLP0conRPLP0conav=19.93av=19.93av=29.63av=29.63controlcontrolIL1-bvitIL1-bvitRPLP0vitRPLP0vitav=19.80av=19.80av=18.03av=18.03experimentexperiment-2-Ct =-2(Ctarget-Ccalibrator)-(Ctarget-Ccalibrator)DNA 芯片结果复证
10、DNA甲基化检测Before Bisulfite Treatment:Before Bisulfite Treatment:Wild-Type DNAWild-Type DNA 5.GCGGACCGCG.After Bisulfite Treatment:After Bisulfite Treatment:Unmethylated DNAUnmethylated DNA5.G5.GU UGGAGGAUUUUG GU UG.G.Methylated DNAMethylated DNA 5.G5.GC CGGAGGAU UC CG GC CG.G.高通量 SNP 筛查Amplifluor Prim
11、er(UniPrimer)QuencherPCRPCRSNP Real Time PCR 技术的诞生技术的诞生1992年，年，Higuchi R等第一个等第一个报导了实时定量报导了实时定量PCR技术技术 Higuchi R,Fockler C,etal.Kinetic PCR analysis:real-time monitoring of DNA amplification reactions.Biotechnology,1993,11(9):1026-1030.所谓 实时定量实时定量PCR技术技术 是指在是指在PCRPCR反应体系中加反应体系中加入荧光基因入荧光基因,利用荧光信号累积实时监
12、控整个利用荧光信号累积实时监控整个PCRPCR进程进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.实时定量实时定量PCR技术是技术是PCR技术和荧光检测技术的结合技术和荧光检测技术的结合Fluorescent Dyes 荧光分子或荧光染料荧光分子或荧光染料Exitation peakEmission peakReactionAmplification PlotTime(Cycle#)Fluorescence荧光信号累积与扩增曲线荧光信号累积与扩增曲线荧光分子或染料的检测方法荧光分子或染料的检测方法荧光分子内参式检测（荧光分子内参式检测（DNA S
13、pecific Dyes）SYBR Green I 荧光标记的特异探针荧光标记的特异探针水解探针水解探针:Taqman 杂交探针杂交探针:FRET（Dual Probes）分子信标分子信标:Molecular Beacons荧光标记引物荧光标记引物:Scorpion 和和 Amplifuor其它类其它类:BD QZymeDNA specific Dyese.g.SYBR Green IExcitation 494 nmSYBR Green I 的检测原理的检测原理Emission 521 nm熔解曲线分析引物二聚体Primer dimersProduct of InterestUNG预防污染
14、52C 2:00 UNG treatment 95C 10:00 enzyme activation60C 1:00 annealing/extension95C 0:15 denat.UNG酶的作用原理是降解含有酶的作用原理是降解含有dU的双链或单链的双链或单链DNA。它在它在50C激活，激活，95C灭活灭活.用于预防非特异性用于预防非特异性PCR扩增和污染扩增和污染。在定量PCR开始前增加50C的保温步骤，UNG酶即可将已有的PCR产物降解破坏，防止可能造成的污染仪器热启动 Innovative technical feature for device-supported HotStart
15、 PCR Perfect combination:Mastercycler ep S and HotMaster Enhances the PCR to nearly the maximum脉冲脉冲 PCR=超快的升温速度超快的升温速度+极大缩短初始升温所需时间极大缩短初始升温所需时间Block temperature CTime100806040206C/sec8C/secTaqMan探针法的核心:利用Taq酶的53外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号 FRET 荧光共振能量转移 Fluorescence Resonance Energy Transfer TaqMan 探针原理T A G
16、 C C T GCAG A GRQReporterQuencherReal-Time QPCR常用染料Alx350Alx350Alx350FAMFAMFAMTETTETTETHEXHEXHEXJOEJOEJOEROXROXROXCy5Cy5Cy5Cy3Cy3Cy3TAMTAMTAMTxRdTxRdTxRdTTTTTAAACCCCCAGG GGGGTTTTTAAACCCCCAGG GGGGTTTAACCCCGGGT A G C C T GCAG A GRQTaqMan 探针原理 当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇
17、到与模板结合的探针，其53外切核酸酶活性就会将探针切断外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号AGCCACCTTTTTT TGGGCCCCAAAAGCCGATR多探针的反应体系多探针的反应体系Two or more Probes and Dyes in one TubeT A G C C T GCAG A GR1QT A G C C T GCAG A GR2QTarget 1Target 2微卫星系统Mastercycler ep-新一代PCR仪的代表超快的升超快的升/降温速度降温速度脉冲脉冲 PCR独立直观的控制面板独立直观的控制面板ESP 电子样
18、品保护热盖电子样品保护热盖Mastercycler ep系列-多种模块选择铝块铝块银块银块Eppendorf在定量PCR领域厚积薄发Mastercycler ep realplex实时定量PCR仪的开发秉承了Eppendorf既往的经验.是将经验融入最新技术的精品之作回顾回顾Eppendorf 60年的发展历史，当之无愧为年的发展历史，当之无愧为高品质实验室仪器的供应商。高品质实验室仪器的供应商。Eppendorf拥有拥有55年生产光学仪器的经验，年生产光学仪器的经验，近近10年来，热循环仪已成为年来，热循环仪已成为 Eppendorf产品家产品家族中的重要组成族中的重要组成。real-tim
19、e PCR 仪器构造Exitation light source FilterDetector 热热循环仪循环仪 光学元件光学元件软件分析软件分析Mastercycler ep realplexA 4-colour detection unit in a space saving designThermal ModuleSliding Optics ModuleMastercycler ep升级为定量PCR仪ep Gradient/S两通道两通道ep RealPlex2四通道四通道ep RealPlex4六通道六通道ep RealPlex6COMING SOON!在Mastercycler e
20、p梯度PCR的基础上，整合一个可靠而高度灵敏的光学检测系统，就构成了最新的Mastercycler ep realplex实时荧光定量PCR系统。Mastercycler ep realplex-模块化设计A.Mastercycler ep realplex296 LED Array excitation at 470 nm1 channel photomultiplier(CPM)2 detection wavelenghts:520 nm and 550 nm B.Mastercycler ep realplex496 LED Array excitation at 470 nm2 cha
21、nnel photomultipliers(CPM)4 detection wavelengths:520 nm,550 nm,580 nm,605 nmTwo Thermo modules Aluminum block(ep gradient):4C/s heating,3C/s coolingSilver block(ep gradient S):6C/s heating,4.5C/s cooling,impulse PCRMastercycler ep realplex2：光路特征96 LED ArrayCPM Detector每个CPM上带两个滤光片96孔激发模式由96个LED（光电二
22、级管）组成的光阵列，依一种一一对应的关系将每个反应管中的荧光染料激发，SYBR Green,FAM,VIC,TET,HEX,ROX,JOE and TAMRA优点优点:设计紧凑，无可移动部件低能耗,无光密度损失相对于传统的卤素灯，寿命更长检测器-通道式光电倍增管相对于传统的光电倍增管，新颖的通道光电倍增管（CPM）结构更坚固，更不易被磁场所干扰快速数据获取:15秒检测4种染料RT CCDiCyclerCooled CCDABI 7000,ABI 7900,7300PMTRotoGeneSensitivityCPMrealplex ep敏感性-Photon cascade creates exp
23、onential signal amplification-“Gain”of PMT adjusts strength of amplificationhvhve-e-CCDMirrorCCD vs PMT检测性能对比检测性能对比CCD无法克服检测的边缘效应快速 qPCR新理念非常快速的温度控制速度，配合快速的检测、直观的编程与软件分析，缩短了实时定量PCR的整体时间。兼顾速度与可靠性,优化参数实现快速PCR试剂与耗材均为开放试剂与耗材均为开放快速Q PCR的实现 主要因素:快速升快速升/降温降温Heating rate:6oC/sCooling rate:4.5oC/son average,
24、a time saving of 15-20 min.减少减少 holding 时间时间快速数据获取快速数据获取减少反应体积减少反应体积Mastercycler ep realplex SoftwareThe software offer the following possibilities for evaluating or viewing the recorded data:-Raw data-Absolute Quantification-Relative quantification-Melting point determination-Endpoint determination
25、/-assays-gene identification-fluorimeterOnline analysis of raw data as they appearSoftware-Absolute Quantification Software Modules:Plate Layout for Absolute QuantificationRed boxes-standardsBlue boxes-unknownsYellow boxes-“-”controlChoose a dyeAuto Series functionCreating dilution series for abso
26、lute quantification is easily done using the“Auto Series”functionMastercycler ep realplex-SoftwareUser can create sub assays to perform different experiments in the same plate,provided that the experiments share the same PCR protocol.Mastercycler ep realplex-Software Software Modules:PCR ProgramMelt
27、ing curve protocolPCR protocol 1 to 5 step protocol temp function pause melting curve end point sound holdMeasuring pointMeasuring point for melting curve analysisMastercycler ep realplex-Softwareep Gradient S:1-24oC(silver block)freely programmable within 30 to 99oCuseful for protocol optimizationa
28、 way to develop fast protocolsMastercycler ep realplex-Software Software Modules:MonitoringMastercycler ep realplex-Software Data Analysis:QuantificationMastercycler ep realplex-Software Data Analysis:Melting Curve AnalysisMastercycler ep realplex-Software Data Analysis:End Point DetectionMastercycler ep realplex-Software Data Analysis:+/-Assays 刚才的发言，如刚才的发言，如有不当之处请多指有不当之处请多指正。谢谢大家！正。谢谢大家！652021/8/26部分资料从网络收集整理而来，供大家参考，感谢您的关注！
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