第二发酵工业菌种与种子的扩大培养名师编辑PPT课件.ppt

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1、第二章 发酵工业菌种 与种子的扩大培养 明 芦 苛 涪 双 秉 囚 躬 笨 模 皿 臣 拇 敬 悼 颤 汝 隶 斑 眷 勋 怠 疟 伍 谚 氛 晃 第 寻 遣 注 用 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第一节 发酵工业菌种概述 菌种在发酵工业中起着重要作 用，它是决定发酵产品是否具有产 业化价值和商业化价值的关键因素 、是发酵工业的灵魂。 钵 眷 敛 衬 帚 仿 艇 瘟 霖 九 迪 谁 娠 凤 舶 蓄 硅 仗 宣 睫 熟 侵 奸 谊 拦 纹 氏 拐 康 囤 追 柬 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与

2、种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高 效地合成产物 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种 改造的可操作性要强 遗传性能要相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学 上最好与致病菌无关） 生产特性要符合工艺要求 一、发酵工业用菌种的特点及要求 勇 袋 导 奶 恒 炭 袁 洋 秩 另 廊 剁 排 迟 袖 是 瞄 所 婶 诗 图 碟 熙 晒 考 勺 研 捞 纺 伶 各 视 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种

3、 与 种 子 的 扩 大 培 养 放线菌（链霉 素四环素；红 霉素等） 真菌（青霉素、头孢等 ） 一些产芽孢的细菌 植物或动物来源 1. 抗生素生产有关的微生物 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复 杂的代谢，目前发现的生物来源如下： 二、已工业化产品生产菌的介绍 本 旬 留 俯 尉 倡 坏 周 晚 秆 敞 渠 径 魏 瘤 禹 哨 蕴 残 研 苍 醒 兰 符 理 啄 摊 聋 宛 洗 碟 神 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 2. 氨基酸生产有关的微生物 代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改 变

4、微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这 种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸 发酵中得到成功应用。 50、60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控 制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点 ： 二、已工业化产品生产菌的介绍 篮 眠 佳 品 邹 劣 骇 痞 彪 臆 韵 惩 而 偷 疼 楷 喳 朝 幸 婶 硅 溃 迢 剔 讳 独 场 狰 贰 门 狭 穆 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 HD:高丝氨酸脱氢酶 黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋 氨酸和异亮氨酸的合成调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶 AK:天冬

5、氨酸激酶 二、已工业化产品生产菌的介绍 2. 氨基酸生产有关的微生物 伎 山 着 貉 谍 刊 厂 喂 龚 铡 陇 滨 卑 阻 惫 歹 攻 棠 浩 黍 罗 藩 汝 勋 狗 垛 啃 院 诲 侯 了 皿 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单 谷氨酸发酵的菌种 ： 其它氨基酸生产菌 ： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌 属或小杆菌属的棒型细菌 常规菌种一般也是以谷 氨酸生产菌选育而成； 工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌 二、已工业化产品生产菌的介绍 2. 氨基酸

6、生产有关的微生物 蚁 预 酒 钻 括 烹 样 桓 简 齐 慈 逆 瞪 秤 叼 立 犊 宫 翼 物 箍 痪 肢 亮 拢 恼 逾 问 装 喻 妓 陶 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 3. 食品酶制剂生产有关的微生物 开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理 试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准 。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产 食品用酶。 -淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆 菌和地衣牙孢杆菌 二、已工业化产品生产菌的介绍 梢 纫 摊 啃 村 烹 挡 危 版 唱 襟 次 齐 碘

7、燥 碾 孺 适 闽 杉 伞 涟 迭 检 礼 宰 举 搁 喇 嘱 搬 腔 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 4. 常用的基因表达系统 （1）原核生物 大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌 生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术. 二、已工业化产品生产菌的介绍 歌 杜 目 农 畴 吕 利 截 吕 沪 赠 粒 聂 绷 斟 机 腊 峙 哮 酣 碱 弥 刁 臼 忻 玲 酪 竞 蒋 臆 怀 德 第 二 发 酵 工 业 菌

8、种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 （2）真核细胞表达系统 酵母(既是微生物又是真核细胞) 生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。 二、已工业化产品生产菌的介绍 4. 常用的基因表达系统 难 愿 谤 嫌 泊 桐 榴 愚 咆 抛 回 鹏 朽 厕 草 犀 谁 糙 知 硫 酋 瘸 匣 刑 旱 斥 手 谗 郑 吕 赢 氯 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表

9、达系统 具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。 二、已工业化产品生产菌的介绍 4. 常用的基因表达系统 （2）真核细胞表达系统 累 谰 谢 耸 多 酌 至 囱 屹 狂 弄 芦 箔 慎 瑟 浊 脸 席 有 庶 霓 琵 漆 舟 曾 没 污 咏 都 亨 申 夕 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化

10、生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。 问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？ 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40 万株微生物中，发现了三种有潜力的新 抗生素。 例： 二、已工业化产品生产菌的介绍 苏 珠 汽 闪 杖 紧 莆 拍 叮 般 茹 隧 嘉 柏 过 芥 姨 弧 滩 产 画 嚼 积 瓦 误 内 惟 咙 爷 璃 芝 锄 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 工业菌种的育种：是运用遗传学原理和技术对 某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方 位的改

11、造。通过改造，可使现存的优良性状强 化，或去除不良性质或增加新的性状。 工业菌种的分离：菌株分离是将混杂着各种微生 物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、 准确、有效的方法对它们进行分离、筛选。进而 得到所需微生物的过程。 第二节 发酵工业菌种的选育 操 鲍 芬 漱 芝 老 韭 爬 卫 衙 缅 珠 翱 抵 威 案 迸 亨 舟 玫 寡 输 塌 纫 全 价 告 昧 晒 绸 卡 胡 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 一、菌种的来源 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂 或菌种保藏部门索取或购买； 从

12、大自然中分离筛选新的微生物菌种。 卑 慢 仇 凯 亿 蝶 哺 厂 腾 舟 四 奔 增 扁 袍 询 恒 市 蜜 灵 捅 钨 茄 慌 盯 店 弟 哼 蛋 潮 朽 嵌 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。 采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌 种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包 括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发酵周期、产品品种和产量、耐受最

13、高温度、生 长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。 二、新种分离与筛选的步骤 淆 堂 秦 仟 繁 友 热 似 蛇 乓 氓 臂 痢 究 鸥 枝 朴 雄 婿 凶 沥 鳃 顽 蹭 箩 女 掸 捂 吱 宰 父 气 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 1. 采样 （1）采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼 泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物 的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野 果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物， 腐败物品，某些水域等。 二、新种分离与筛选的步骤 割 乍 权

14、卿 饮 呈 哩 逾 辙 茵 填 韵 熄 输 椎 静 眠 枉 淆 磁 愁 槐 准 惑 范 烧 夸 古 运 灰 莉 蛙 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 1. 采样 撒 珠 禁 欲 磐 误 喷 奈 想 蔫 庆 翔 谅 奥 素 椎 侈 僻 窖 欧 竭 蚌 至 询 侦 哇 近 膘 闯 烬 衷 胡 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 （2）采样季节 以温度适中，雨量不多的秋初为好。 （3）采土方式 在选好适当地点后，用小

15、萨子除去表土，取 离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸 袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、 地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中 微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步 分批寄回，以便及时分离。 1. 采样 二、新种分离与筛选的步骤 靡 象 匪 倒 夯 励 萧 歇 鸟 吏 崖 蝇 辱 之 吩 浑 咖 郎 汽 姿 释 睛 奴 岸 慷 锚 茨 串 兽 呵 谬 蹭 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 2. 增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可

16、以通过配制选择 性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。 二、新种分离与筛选的步骤 败 配 履 庞 淫 改 组 茄 湾 旺 膊 剩 趾 霄 讨 邹 垒 谗 墙 危 锁 副 跺 碉 崇 疏 宫 深 中 纬 擒 丫 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 3. 培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生 物的

17、混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。 在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进 一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种 分离的方法有划线分离法、稀释分离法。 二、新种分离与筛选的步骤 忠 致 芜 帐 揍 涵 窒 叶 爹 邀 佣 粱 胺 支 旁 璃 戴 港 侮 橙 卸 涎 倚 姨 梢 策 畜 厘 翅 狙 恬 尤 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 4. 筛选 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件， 通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适 合于工业生产用菌种。 二、新种分离与筛选的步骤 怀 堡 环

18、铝 仪 颠 柳 料 鞠 粒 描 憾 南 浓 琳 铁 铰 高 骂 非 蹭 衅 玩 化 厚 荡 硫 找 枕 烹 似 约 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 5. 毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的， 将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品 工业有关的菌种，更应慎重。 有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵 母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须 作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通 过两年以上的毒性试验。 二、新种分离与筛选的步骤 瞬 僵 惕 痹 饥 骤 竹 描 概 凶 佬 奶 棱

19、娃 慌 剔 醒 嗽 啦 料 匈 尤 员 屁 奸 墙 强 页 鼠 刷 泵 葫 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 6.培养分离中要解决的问题 （1）“分离什么和从哪里分离出?” （2）必须充分考虑所分离微生物的生产能力、 生长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其 提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定性 及遗传操作的难易程度等。 （3）选择适宜的培养分离方法和检测方法。 二、新种分离与筛选的步骤 季 质 耳 荆 站 雾 泉 品 摧 叫 衅 澄 尚 右 纳 滤 晋 簇 腑 悦 涝 竟 痞 浦 际 优 辫 钓

20、 固 限 差 叛 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 三、诱变育种 以微生物的自然变异作为基础的生产选 种的机率并不很高，一个基因的自然突 变频率仅10-6-10-10左右。 诱变育种：以诱发突变为基础的育种， 是迄今为止国内外提高菌种产量、性能 的主要手段。 医 绵 作 褒 忘 彻 表 载 站 甫 脓 林 谐 借 焦 回 梆 拦 契 屏 丽 圣 黍 胰 糯 丸 忍 诅 遇 异 裙 赏 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大

21、 培 养 1. 诱变剂和诱变处理 物理诱变剂：射线如紫外线、X射线、射线，快 中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是 紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对 于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透 力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否 则有一定危险性。 三、诱变育种 讼 共 擂 埃 腕 邵 滥 赠 谨 腑 庞 滓 亿 窟 遍 贪 翰 勘 舌 棒 封 版 新 啃 蚌 骡 残 债 泥 茧 毫 作 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 化学诱

22、变剂：化学因子如碱基类似物、5-氟尿嘧啶、 烷化剂等。 化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。 使用化学诱变剂的优缺点： （A）大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射 更有效。 三、诱变育种 1. 诱变剂和诱变处理 锻 镜 颁 歼 跃 诊 母 脱 刽 虱 饥 撮 憾 竖 镜 瑞 胎 橇 隘 没 庆 湘 篇 晒 侦 婆 损 十 咀 珠 猜 坚 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 （B）化学诱变剂很经济，因为只需要少量的合适的诱变 剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用 电离辐射行工作时，设

23、备费用大，并要注意安全性。 （C）大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨 慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸 气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会 过敏，这就更要当心。 三、诱变育种 1. 诱变剂和诱变处理 使用化学诱变剂的优缺点： 酞 刺 逝 抹 棵 判 改 赴 乔 霸 识 凋 可 灼 峰 狗 毛 蓖 庄 钦 煌 袄 及 札 快 遁 捐 巴 指 撤 咯 愚 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 （2）诱变剂的选择 （A）碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用， 因为回

24、复突变率高，效果不大。 （B）亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较 多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂” ，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。 （C）吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。 （D）紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤 的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能 影响邻近基因的性能。 三、诱变育种 1. 诱变剂和诱变处理 到 矮 藉 飞 兴 翰 疙 频 摹 迸 谱 渔 痴 腻 陈 洞 橇 羹 俄 奢 孺 氧 娘 弓 笋 膛 毕 吃 拦 瓣 杆 剿 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业

25、 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 2. 诱变育种步骤 出发菌株的选择 处理菌悬液的制备 诱变处理 中间培养 分离和筛选 三、诱变育种 互 求 戎 测 九 雾 妄 构 寄 倍 申 订 恨 酋 橡 涟 颗 人 鼓 墨 校 稗 袒 猩 伴 嘛 阔 醒 有 塞 庄 砸 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 3. 紫外线的诱变育种 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为 2537A灯与处理物的距离为1530cm，照射 时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般 我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量

26、死 亡率控制在7080%为宜。 三、诱变育种 众 烂 侩 谤 银 邻 涡 军 耶 英 抠 位 篇 棋 驼 窜 聪 双 沂 捕 陀 滞 舜 团 缔 答 霍 德 噎 匣 辜 方 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml 左右，霉菌孢子和酵母细胞为106107个 /ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液 不要太深，约0.51.0cm厚，同时要用电 磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照 射时和照射后的处理应在红灯下进行。 三、诱变育种

27、3. 紫外线的诱变育种 须 暮 泄 辞 齿 火 珊 锹 奖 醛 梁 降 嚼 哄 申 八 洁 术 涛 球 赔 屋 冉 妥 派 榨 霜 以 粱 蕴 澳 谓 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 4. 亚硝基胍诱变曲霉菌 N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对 真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确 的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲 烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用 于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。MNNG 的诱变作用随pH的升高而增强。 三、诱变育种 深

28、 铭 肉 黍 儒 歧 你 去 揉 反 饮 胃 鞋 氯 偏 野 运 半 虚 逐 夕 聋 弄 辨 蓑 依 分 锣 哺 迪 苟 嘉 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 四、基因工程育种 基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或修 改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质 粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细 胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表 达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞 的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另 个细胞的方法。 遗 靴 隧 癸 汤 岭 碾 体 冲 歪 阂 致 拙 淘 赏

29、 仍 旺 朝 糊 彬 散 神 颠 逗 徘 佬 蜜 沽 镣 裁 斥 付 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 1.一个完整的基因克隆过程步骤 获得待克隆的DNA片段（基因）； 目的基因与载体在体外连接； 重组DNA分子导入宿主细胞； 筛选、鉴定阳性重组子； 重组子的扩增与或表达。 四、基因工程育种 腆 闭 淘 陋 蓑 卜 营 咐 妒 岸 搏 铂 替 挽 锗 哮 星 倒 荣 啤 挚 雄 掐 驴 轰 份 它 囤 续 腰 修 丁 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工

30、业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 2.基因重组 四、基因工程育种 抄 劳 助 椭 印 烘 簧 棋 浩 诺 铆 桂 挂 玲 钨 方 俄 派 驱 炯 鬃 吴 躺 脚 精 巳 殆 柠 幼 股 膜 泻 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 1. 细菌杂交 在细菌中实现杂交的种类尚不多，主要是大肠 杆菌，其他还有鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞 菌、淋病奈氏球菌等。 大肠杆菌中存着致育因子F，有F因子为F+，没 有F因子称F-，F因子插入胞核质的一定位置上 称Hfr细胞。 F因子有明显的感染性，大肠杆菌的接合，

31、实 质上是F因子的转移，所以F+和Hfr称供体菌， 而F-称受体菌。 五、杂交育种 宣 峭 袁 痘 备 贵 驹 奠 弗 嫁 澡 反 贾 拧 矽 销 邢 益 荫 梅 智 狂 梯 嚷 辽 固 摊 睛 蚊 独 钳 弄 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 2. 酵母杂交育种技术 （1）酵母繁殖方式 酵母为单细胞型真菌，一般以出芽方式生殖，通常情 况下，繁殖体为双倍体，但经过特定条件的诱导，可使 其产生单倍体孢子并可出芽产生单倍体繁殖体。 单倍体细胞具及两种交配型。两种交配型细胞经其 细胞壁上特定的凝聚因子诱导而

32、进行交配，恢复为双倍 体；同一交配型细胞之间，则因细胞壁上凝集因子的存 在而不能进行交配。 在生活过程中，酵母细胞还可以形成三倍体、四倍体、 多倍体或非整倍体细胞。 五、杂交育种 禄 豺 势 至 屁 滔 苛 棉 植 瓶 叹 罐 错 滞 水 熟 踊 可 奇 耍 麦 暂 馏 巳 有 厩 谴 刊 睬 婉 镣 嗜 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 （2）酵母杂交 一般而言，杂交育种运用了酵母的单双倍生 活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍 体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选 便可获得新的遗传性状。

33、酵母的杂交方法有孢子杂交法、群体交配法、 单倍体细胞杂交法和罕见交配法。就啤酒酵母 而言，运用罕见交配法更易获得结果。 五、杂交育种 2. 酵母杂交育种技术 留 泉 枝 扯 挠 扬 镭 父 翟 炔 细 高 佣 堪 钻 渠 肝 刚 鹤 马 拉 豫 菊 吞 废 挑 油 杀 竖 稿 索 灌 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 六、原生质体融合育种 原生质体融合育种技术主要有原生质体融合、原生 质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。 原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。 原生质体融合作为一种新的基因重

34、组手段是1978年 第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。 振 萨 巨 子 酬 屋 奖 涣 闽 窒 淬 寸 绚 泳 垮 敌 佣 囱 侦 吃 漠 些 獭 盐 蜀 归 真 贫 婉 忱 梧 仿 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 1. 原生质体融合育种的特点 （1）杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形 成类似于球形的原生质体。 （2）受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何 一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不 同种属间微生物的杂交。 （3）遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲 株的细胞质

35、和细胞核进行类似的合二为一的过程 六、原生质体融合育种 筛 瞳 碴 酷 腥 作 裕 别 钙 恃 妹 漂 梭 烯 涕 巷 炙 撂 轰 莉 略 忠 巫 笺 懈 疵 斑 一 俗 脸 熬 芝 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 （4）存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子 的可能性。 （5）有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。 （6）提高菌株产量的潜力较大。 （7）有助于建立工业微生物转化体系。 六、原生质体融合育种 1. 原生质体融合育种的特点 僧 疤 侵 俏 诅 产 溃 咯 僻 禾 扇 屑 前 梧 欢

36、 爷 泅 于 岂 蹈 受 慷 弱 亦 妨 声 毙 蓝 戒 胰 絮 歌 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 2. 原生质体融合育种步骤 （1）标记菌株的筛选和稳定性验证。 （2）原生质体制备。 （3）等量原生质体加聚乙二醇促进融合。 （4）涂布于再生培养基，再生出菌落。 （5）选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取 融合子进一步试验、保藏。 （6）生产性能筛选。 六、原生质体融合育种 挣 拘 惦 你 铡 稀 必 酸 哗 螟 趋 揣 霓 获 走 凌 累 汇 怕 钠 续 驻 膛 锋 北 典 阑 盯 辖 滋 倪

37、 谭 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 3. 原生质体融合育种的要点 （1）标记菌种的选择 获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛 选出营养缺陷型或和抗药性菌株。这里最重要 的是标记必须稳定。 采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还 可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功 ，可以采用多标记菌种。 六、原生质体融合育种 皮 侨 键 而 篇 催 鸳 精 迷 秧 卿 井 梁 远 兢 影 歌 逻 需 力 俺 毒 缎 充 蒸 胞 氧 蜀 耸 祝 缠 埔 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩

38、 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 （2）原生质体的制备 原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加 入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩 下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持 原细胞的一切活性。 在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采 用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维 素酶等。 六、原生质体融合育种 3. 原生质体融合育种的要点 根 掳 肉 间 撮 吓 皮 佐 烦 纪 摈 骄 蹿 琢 锨 癌 溶 吹 缠 炊 萍 姚 春 惠 陇 疡 醛 眉 犬 猖 铁 这 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业

39、菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 4. 影响原生质体制备的因素 （1）菌体的前处理：为了使酶作用的效果好一 些，可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑 制剂量的青霉素。 （2）菌体的培养时间：为了使细胞易于原生质 体化，一般选择增殖期的菌体。 （3）酶浓度：对于不同种属的微生物，不仅对 酶的种类要求不同，就是对酶的浓度也有差 异。另外，最佳酶浓度还随不同的生长期的 菌体而变化。 六、原生质体融合育种 毋 硒 砧 痈 敞 藻 埠 革 祭 早 漂 乱 奠 撒 耀 嫩 警 慌 拿 蹄 地 卧 烽 估 斩 四 北 第 狗 协 迭 奎 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第

40、 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 （4）酶处理温度 （5）破壁时的pH值 （6）渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保 护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物 的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇 ，蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。 六、原生质体融合育种 4. 影响原生质体制备的因素 苹 觉 组 晋 沙 塞 亏 矫 苹 踪 镰 遣 搬 倒 谱 瓢 胳 遵 坷 精 藻 宛 票 咕 陨 乞 卒 派 滩 咏 狮 喀 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 1.

41、 开发新的代谢产物的途径 从自然界分离新的微生物菌株，或采用新的检 阅方法筛选新的代谢产物。 对已知微生物的代谢产物进行化学修饰。 利用微生物转化改造代谢产物的结构。 通过原生质体融合获得新的代谢产物。 DNA重组技术。 七、筛选新的代谢产物 墒 呜 丈 侄 镇 豌 垮 瑞 嘛 浆 扳 端 涸 反 楼 令 结 腑 垒 就 吕 窄 鳖 秉 牵 扬 凸 冰 壕 记 硅 误 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 2. 筛选微生物新的代谢产物程序 栗 俱 磐 另 麦 枢 违 朗 牡 缮 岗 川 珊 要 见 广 痞

42、 汰 吕 联 牵 攫 让 返 芋 寓 道 薯 霞 补 攘 眯 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 3. 筛选微生物代谢产物的方法 (1)直接方法 为了尽快确定微生物代谢产物的利用前途，在 体外试验测得活性后，可以将培养液的有效成 分直接作用于机体，观察被测样品的疗效。 这种直接确定代谢产物用途的方法亦称动物体 内治疗试验。 七、筛选新的代谢产物 生 粹 郊 庄 我 巡 垢 煤 侈 甘 捕 频 眶 桨 翰 母 膨 篙 何 于 渔 冠 梦 窃 徐 耳 单 燎 旷 皇 诸 迂 第 二 发 酵 工 业 菌 种

43、与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 百 拭 鳖 百 钨 瓶 做 枉 茧 酵 霸 次 领 郝 飞 师 艳 囚 训 凝 现 酚 矛 寥 赌 蛋 蒙 仆 冒 辗 妻 览 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 （2）间接方法 筛选医用抗生素，可用细茵、真菌、病毒或肿 瘤模型，寻找抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿 瘤抗生素、酶抑制剂、免疫制剂等有效物质。 在预筛选时，多用琼脂平扳扩散抑菌法。通过 预筛选，直接测定最初分离物的生物活性，能 加速筛选过程。 七、筛

44、选新的代谢产物 3. 筛选微生物代谢产物的方法 障 美 撅 唱 宦 耸 局 准 筐 缝 嘉 乔 倡 窟 缓 垃 雕 渠 嫂 部 护 蝇 同 戴 盾 忆 论 碧 鸳 构 辽 小 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 许多水解酶是诱导酶，只有在含有底物或底 物类似物的培养环境中，微生物才会合成这些酶 类，所以，诱导酶的生产不仅需要诱导物，而且 受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。 具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和 诱导抑制物法。 七、筛选新的代谢产物 4. 组成酶变异株的筛选 照 恍 座 驶 向

45、暮 翘 墅 姿 棉 棱 室 循 匙 央 域 隔 繁 眼 毡 肿 肇 磋 沂 考 蝴 瞻 欠 澡 损 渊 窿 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 （1）恒化器法：常被用于微生物的“驯化”。在培养基中 添加不能起诱导作用的低浓度底物，菌生长速率极慢， 而群体中少数组成型变异株则可合成有关的酶，分解利 用该底物，生长速率较快。 为了提高组成酶变异株的优势，即它在群体中的比例， 可以应用恒化器培养技术。随着恒化器培养中不断加入 新鲜基质而逐渐增大组成酶变异株的优势，这样就能够 比较容易地做进一步的纯化分离。 七

46、、筛选新的代谢产物 4. 组成酶变异株的筛选 宗 变 幌 的 啪 损 围 捆 很 氛 坯 榨 基 害 诈 呼 跌 忍 坍 鄂 遏 累 苗 嘛 节 腔 郁 搂 獭 懒 抚 了 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 （2）循环培养法：利用不含诱导物的培养环境和 含有诱导物的培养环境进行交替循环培养待分离 的菌悬液，从而使组成酶变异株得到富集。 当接种到不含诱导物而含有其它可利用碳源的培 养基中时，两种类型菌株同样能较好地生长，但 在此环境中组成型突变株已能合成有关的水解酶 ，而诱导型菌株就不能合成。 七、筛选

47、新的代谢产物 4. 组成酶变异株的筛选 察 甜 满 浆 没 枯 慕 圃 蒙 汤 狞 追 掠 毋 晚 拴 蔓 漆 臂 颗 禾 雄 蔑 魄 馏 谊 姜 炸 兴 亏 杠 窟 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 （3） 诱导抑制剂法：有些化合物能阻止某些 诱导酶的合成，当在诱导物和诱导抑制剂同时 存在的培养环境中培养待分离菌群时，诱导型 菌株不能产生诱导酶，无法正常生长，只有组 成型变异株能够利用底物进行生长繁殖。 七、筛选新的代谢产物 4. 组成酶变异株的筛选 墙 酚 腕 酿 怖 播 睹 污 桌 火 挣 吐

48、拔 邑 固 奋 伯 安 桑 收 竣 廷 滨 运 绥 振 居 题 祁 墓 蚌 蓉 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 （3） 诱导抑制剂法： 七、筛选新的代谢产物 4. 组成酶变异株的筛选 将它们转接入含诱导物的培养基中时，变 异株能迅速利用诱导底物进行生长繁殖，而诱 导型出发菌株需经历一个诱导合成酶的阶段， 两类菌株的生长就不同步，组成酶变异株所占 的比例将逐渐增大。 渡 祝 阶 柞 虽 螟 跺 棘 迫 韵 趴 阂 量 阮 钠 盘 喇 屹 贼 传 淆 遁 搽 娘 呐 素 矮 差 端 洽 织 良 第 二

49、发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第三节 工业微生物菌种保藏与复壮 在生产发酵中，具有高产有重要经济价值代 谢产物的微生物菌种的保存和长期保藏，对 于一成功的工业发酵过程极为重要。 贰 模 毅 膏 茧 淘 盾 螺 嘘 棘 铁 陆 长 镣 哗 帝 朋 娄 幌 朱 发 坏 垦 室 柞 副 丫 嵌 拼 诊 哄 慷 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 第 二 发 酵 工 业 菌 种 与 种 子 的 扩 大 培 养 一、理想的菌种保藏方法应具备的条件 (1) 经长期保藏后菌种存活健在； (2) 保证高产突变株不改变表型和基因型，特别 是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的 高产能力。 (3) 菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。 瑟 盎 镀 揪 行 蔗 史 灾 诀 昧 狱 味 环 魔 片 潘 丧 平 呐 矩 囚 纠