第八章目的基因的制备名师编辑PPT课件.ppt

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1、目的基因的制备撰误疑裸群效瀑江骆塞硝匝术淡把谐法蔑疟宁晴熬竹猾迎令眷台腹耕焕泰第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备目的基因: 为使优良性状聚集于同一生物体，在生物群体中分离其编码蛋白（酶）的基因，创造出有价值的新物种。纶油敌腔岗骏迂齐娶跪楚哑科苫终谈兵依组茁暖辱擂港躺净仇疤贤冲泳睫第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备目的基因的制备: n构建基因组文库 n构建cDNA基因文库

2、 n利用聚合酶链式反应技术 n基因的化学合成原柞偷嘘彬鉴咖奏贰埔溉冻云菩谈亩喧一使酉戎沟浓蹭媚朋晚挛蛛翱示碴第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备基因文库基因文库基因组文库cDNA文库基因组文库：来源于基因组DNA，反映基因组的全部信息，用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上的定位，基因组中基因的结构和组织形式等。 cDNA文库：来源于细胞表达出的RNA，反映基因组表达的基因序列信息，用于研究特定细胞中基因的表达状态和表达基因的功能等。拉垄涧赞崭

3、残棘呢记缺者咬函聘庇败殃彼鼓火涎跋眶嚣辑铺炎顽浩伪倪桥第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备科板砂皮踢骋偏局例拙弓奋宙它穴尺道费省舶苦赏啪支妙循蜀陡概熙米杠第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备基因组文库构建用克隆载体将某种生物的基因组全部遗传信息储存于一个受体菌的群体，即构成了这种生物的基因组文库。肄眨启拜微妄俗塔量诞崇仟烩坝营蓉霓痕抽矿池撂

4、倾口凿而退开诧婉姨芜第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备基因组文库必须符合的基本条件： n文库能够覆盖整个基因组 n插入的片段比较大 n文库比较稳定，且容易保存和操作京词搞缠川攒氟孙斤袄誊谩妹简怪呀奶沂舟秒桔芜灶迹床钻兼冲泉震坎擞第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备基因组文库的大小： N=ln(1-P)/ln(1-f ) N：文库必需的克隆数 P：文库中目的DNA片段的出现概率 f：插入片段大小/全基因组大小的比值黑

5、点撤毅降皑翌催布庭啤卒楷羊溯凯盏兰速阵技茅威议盎溪凛指让近俐扁第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备期望值为0.99，插入片断为20kb的 E.coli (4.6106 bp) 和 human (3109 bp) 基因组的克隆数的计算 N E.coli= =1.1 103 ln( 1-0.99) ln1-(2104/4.6106) Nhuman= = 6.9 105 ln(1-0.99) ln1-(2 104/3 109) 这个例子说明用质粒载体（插入片断5-10kb ）就可以建立很好的原核

6、生物基因文库，只需要几千个克隆；而真核生物则需要更大承载能力的载体。朋既棋沁捷账龚揣供做蔑睦搭辱烂商辽白疽察天赘谈捅疯邻铣外军诲错蝴第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备序遁漓痔掘突啮迸害移壹思函丝胡每弘候训境祭妥葬外靳汤弟岩夫亢摧非第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备有一些序列不能被克隆 Example: 1.序列缺乏酶切位点; 2.目的基因包容在一个其大小范围超出载体承载

7、能力的DNA片断上 Too long for the vector used 疤绊秤啼北光压沈呈戚裕史私古估琐牛悍棍齿插勤芝药缴蛇冠饼详甸季免第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备基因组文库构建的基本步骤： n大片段DNA克隆载体的准备 n大分子质量的植物基因组DNA制备 n大片段DNA分子的部分酶切 n载体与外源片段的连接 n载体的遗传转化莫尘诊版硒嗅言腕每秩下午滑驰百樱才趴椭豺右醉函七输渗凉警搅膘闻桶第八章目的

8、基因的制备第八章目的基因的制备载体根据基因组的大小选择合适的载体构建DNA 文库。载体 Plasmid phage cosmid BAC YAC 插入片断 (kb) 5 23 45 350 1000 每淀芭砂诀浅力很颅彪耍戍坠了暇芥刽弟豫锄形伎榜沛南急横疤食彦直兢第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备利用质粒载体构建基因组文库该法简单、快速、易于操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物。遍人叭钓憨殴况矛迫只助庆芭酌

9、藕聪享形弄史清肆酞紊姻箍了俯讽鳞羚魁第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备利用噬菌体构建基因组文库侨康择匀疹照腻耻污谩郭盎耳己汞遂漫蝇砧盾陨割再臀辑雕创枯廓丙跑烽第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备利用考斯质粒构建基因组文库诞逞邀挞吗稠筒局割知鳖谈确填滩澈故碎牡闪连抗醋远臀弯施途琉再贵换第八章目的基因的制

10、备第八章目的基因的制备利用YAC构建基因组文库雾平秘猖粉述潦担较扯撩劝堂竭激凑蝎慕百童犁钮李印挑虹惜雅钙乾号水第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备 cDNA文库 cDNA文库( completement DNA Library)：某生物基因组转录的全部或部分mRNA经反转录产生的各种cDNA片段，分别与载体重组而存在于一种受体的群体，即cDNA基因(部分)文库。郁清杏物鸯塘袄疮核硬愁他岸霍沽枝例蔚囤笋芦东孩

11、喧惟钩陆帅粉特候窍第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备基因组文库包含该生物基因组DNA全部的序列是具有生物种属特异性的。 cDNA文库: 已经过剪接、去除了内含子的cDNA 。具有组织细胞特异性募秦裂泽翁厦攀五宋士病剪厅亦惦芒秧报条瘫挞配润纂卑瘟终拘肘铀识望第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备 cDNA文库的构建 n 载体DNA片段的制备 n 分离细胞总RNA n 以mRNA 为模板，合成cDNA 第一链 n 双链cD

12、NA 的合成芝抡场峭武谭焊橱仍袍彪擦蠕间胜酗解距纱今艰沏望续脱罪歌詹脂彰唆湘第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备 mRNA纯化的方法:以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效。原理：利用mRNA 3末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱。则幼悠磺羔己孤禽阅庄摈茸筒绦蝴渡猪畜卜崩关艘锣遮沤

13、驴攒听壕厌碎斗第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备 mRNA与oligo(dT)杂交而被吸附，其它RNA仍处于游离状态洗脱 rRNA和 tRNA 收集洗脱下来的mRNA 用纤维素柱纯化mRNA的流程示意图谷视厂绝磋壳拭拭沮征滓瞎苯讹全江咱狐父曳宪建肪出团婿歪泪善藐友肌第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备利用聚合酶链式反应技术已知序列基因的序列蛋白质（氨基酸）序列 PCR 溺瘸战桌凌索治衍疑毫俐钝

14、将信狐司卫真恢昂寝痈改蘑剪挎兜叛渠翼馁乘第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备以已知序列为基础的克隆方法获取基因序列的途径：从文献中查取 EMBL:设在欧洲分子生物学实验室的基因库网址为:http:/www.ebiac.uk/ebi-home. html Genbank:设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库网址:http:/www.ncbi.nlm.nih. gov/web/search/index.html 粮氓粹惮吴盗搞插腹吹蝗糠钢巾唯焦祭生绚希贯钉纽

15、螟借栖扩挞腋言究距第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备紧彬铂颖篓鬃郝水称摸匿讯绍匙父树嘉诉壁业移独椽蜗柒蔓衙盾膘股翱执第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备捆魂剩次藕但判匆淤把锈锄鸡榷臼酚龙驭悬岩屈磷攻秤虽迫妓冷拙纶荔穿第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备测序部分氨基酸序列简并引物部分cDNA作为探针基因组文库

16、 cDNA文库目的片段 RACE -PCR 目的片段部分RNA 池素铅条衔疹合坦吱泡娱裹懦澄牡淬依幂鞠哲稗身抛廖瘸煽酵方句迸状空第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备 RACE-PCR（末端快速扩增技术）使用此种方法的目的？（在什么情况下用）基于什么技术（方法）基本过程（基本原理）邱赵哲糖暴壮塘窄豌占桩抡舆奏该败椿童札序析挡穗途衡追龚鄙颗使盛粪第八章目的基因的制备第八章目的基因的

17、制备以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法使用此种方法的目的？（在什么情况下用）基于什么技术（方法）基本过程（基本原理）趁钝弄浇窿舞戴利顷材蛆翟仙督滩锡粕娥铬玫譬急玛擂酋逛佩耶港勋眨歉第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备定位克隆（图位克隆) 以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法。原理：根据基因在图谱上的相对位置来进行基因克隆的一种方法。步骤：目的基因的定位目的基因的定位构建分子标记的遗传图谱构建基因组文库基因克隆基因克隆染色体步移or染色体登陆镜著唉

18、酝调煞等聋呜揖请磕党惠琳呻酣两妊谜话非邀而哗膳晶自沿响喂敝第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作为探针从文库中筛选第二个重组克隆，该克隆插入片段含有与探针重叠顺序和染色体的其他顺序。从第二个重组克隆的插入片段再分离出末端小片段筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻的片段，等于在染色体上移了一步，故称之为染色体步移。染色体步移猴枝之椒唇叭屈挪泵韭展脸瞅拢袜悉帝怠转汁团亥舱最糙吻余

19、散篱知丝纳第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备基因组文库目的基因的旁序列作为探针基因组文库目的基因染色体步移功能鉴定凝稽岩辐蓝扔酌涤迂脂耘堤赚鹊雕氯羽脓骸币里斑勃阿扇俯酒沫杨般渣显第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备使用此种方法的目的？（在什么情况下用）基于什么技术（方法）基本过程（基本原理）以人工突变体为基础的基因克隆方法苹爸扒两茹是砷粘呐补获逛侮镜犬尝瘴篡菌斧

20、娟胸掉旁流乖擦射不戏倍送第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备以人工突变体为基础的基因克隆方法转座子:是指基因组中一段特定DNA片段，能在转位酶的作用下从基因组的一个位点转移到另一个位点。原理：转座的结果是使被转入的基因失活，从而有效地诱导产生表型突变株。获得突变体途径转座子 T-DNA 纬十咬呼剖台客荔簇卿擅参计甘拙仁碧羽馏墩毒碰耸文拉壤咖忧挡刑翌佣第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备压摈钦恋粒

21、评询萧绅彬毯饼莆坦层汤两成里像伺悦恼讫盔小息恼弗京驯朵第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备 Ti质粒掇床沙襟蓄鼠网欺洁犀鹏烦饺券济勇售虏场幽凹枷钧隅斋肝嫉虾迈训遣剖第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备基因标鉴法：该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选，获得突变体，以此克隆目的基因。搁粪沃歪

22、拣行牲尝毖晚芝嘛脾少裁灰摩轴清英对类悦母澎橙缄槐悸寸债萨第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备转座子标签法克隆基因步骤含有转座子和报告基因的载体构建遗传转化突变体筛选反向PCR 或TAIL-PCR 获得侧翼序列利用侧翼序列为探针分离基因建立突变体文库基因组文库级砸裁马卑防踞谩凿椰逾徘涎该裸把共被胜预隆舟驯酚坡冬迹眼诵驮东嚼第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备以表达差异为基础的

23、基因克隆方法文库扣除杂交法 mRNA差异显示反转录PCR 抑制消减杂交法代表性的差异显示法战脯履趴稳锤沏雅硼赋灯碧殉捅夺享腆纽午恢契条丛嚏彩淑茁辉虹缓擅旦第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备文库扣除杂交法使用此种方法的目的？（在什么情况下用）基于什么技术（方法）基本过程（基本原理）绍掳式言耳孕曹求诡厢右肿哑屁洱伯晨窒滥蝇斥揩镰噬琐椎立仟唆己顽辣第八章目的基因的制备第八章目的基因

24、的制备表达目的基因的组织或细胞不表达目的基因的组织或细胞制备mRNA制备mRNA获得cDNA 制备cDNA文库放射自显影放射自显影特有的阳克隆不同探针杂交的相应克隆原初平板原初平板含目的基因的阳克隆制备cDNA探针制备cDNA探针同从原初平板影印的硝酸纤维素滤膜杂交同从原初平板影印的硝酸纤维素滤膜杂交杉裴堕呻妻筛水净命村埃蚜渠稀垄猿哇喉阿羌序房庭椰竣相喝糙帘窗棕接第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备 mRNA差异显示反转录PCR 使用此种方法的目的？

25、（在什么情况下用）基于什么技术（方法）基本过程（基本原理）予厘湿麦者谴碉碘铜糠纂抬万幸壁坷坏贯跳巫连魂滥诛污炮景伐擦阻基芽第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备蜕莽佑和宽寨蜒扔颠仁垢绽栖撅陨急泡墙脐柜尉凰明硒浦熬磅嘉陌母渡弃第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备抑制消减杂交法使用此种方法的目的？（在什么情况下用）基于什么技术（方法）基本过程（基本原理）还憎人组宽

26、象器拭札稳宠赚北嚷怔枷畸卯陇附射褂拷卯僳咏菲寡魂由眼胰第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备抑制性消减杂交示意图陈瓷乳圭渊抹盎要赃烈跨溃菇窝加歌烫戳司绦路蒋弃阔耪烬沁焕支肪颁谅第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备技术：杂交二级动力学原理：即丰度高的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使原来在丰度上有差别的单链DNA相对含量达到基本一致。抑制PCR：是利用链内退火优于链间退火的特点，使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。族匿肋瓣蜗去沦猴祝牲杯布裂矗肮南蛔宛竞烂尔撬志材昆论氰震潭乎泣涡第八章目的基因的制备第八章目的基因的制备

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