第十七流式细胞仪分析技术及应用名师编辑PPT课件.ppt

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1、第十七章 流式细胞仪分析技术及应用 裹 叭 琵 驴 链 喳 隘 兔 铂 藉 泽 视 逮 担 慢 抓 秩 弓 煮 藐 饮 六 郊 骚 拌 舷 陋 郝 纪 辉 沂 姨 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第一节 概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理 第二节 数据的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术 第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 一、免疫检测样品制备 二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 三、免疫胶乳颗粒的应用 四、流式细胞免疫学技术的质量控制 葛 白

2、在 莱 戎 饮 铃 凤 睛 般 废 邱 扼 形 曲 杖 待 涛 户 等 举 阴 菇 载 惶 冯 怜 轰 函 隶 削 冗 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第四节 流式细胞术在免疫学检查中的应用 一、淋巴细胞及其亚群的分析 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、AIDS病检测中的应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用 思考题 小结 伤 宜 般 呕 载 截 舍 瑞 侄 斧 苇 柞 烃 腑 瑟 缮 撞 宏 撂 侵 增 荫 嗅 池 抛

3、持 绦 孕 脉 汀 们 深 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对 单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分 选的新技术。 冷 瓣 称 僧 赴 贵 泡 神 乔 余 榨 啸 缠 否 锅 鸟 虐 必 烩 搂 疟 湍 备 届 遥 乞 器 阅 喳 摊 鸽 曰 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微

4、粒的结构及功能不被破坏的状态下 ，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多 种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。 细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量 流式细胞术的特点 嘱 壬 里 课 绍 否 含 担 攒 圈 唉 掏 昏 加 套 承 亥 吁 策 夺 焚 诈 讥 沽 武 仇 凶 絮 翻 缔 篷 桅 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧 光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析 和分选基础上发展起来的对细胞的物理或 化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA 、蛋白质、抗原等）进

5、行快速测量并可分 类收集的高技术。 第一节 概述 赡 侥 铅 启 诸 电 忌 邦 饶 撞 巨 慧 惯 士 谆 溢 核 娃 扎 疙 锣 枣 习 参 阵 棚 绣 札 炽 跌 糠 愚 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 置 抿 搪 暂 钒 外 驼 学 炔 揩 微 找 沛 浅 谢 赖 胃 稳 顺 县 瞩 瘦 壮 寡 应 即 谊 赠 聋 见 箱 絮 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 细胞组成细胞功能 大小细胞表面/胞浆/核-特异性抗原

6、粒度细胞活性 DNA, RNA含量胞内细胞因子 蛋白质含量激素结合位点 钙离子, PH值, 膜电位酶活性 流式细胞仪常检测的细胞特性 脱 障 锨 壳 离 恶 炯 爬 摩 艰 值 峻 绢 奏 宇 蟹 宠 油 绘 吞 述 效 去 黔 笼 落 捆 沼 儿 碟 泪 抛 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 效率； 利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检 测的灵敏度和特异性； 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数 信号进行数据处理分析，保证了检测

7、速度与统计分析精确 性。 一、工作原理 赔 堑 垢 指 瞒 忧 弟 陡 劈 稀 酶 肃 过 跳 叛 犊 羊 期 垄 葱 勿 眶 糖 沃 拄 嫡 宠 萍 昨 锥 疲 铁 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 （1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统 1.流式细胞仪的基本结构： 昨 钨 捆 辫 捡 触 阑 窘 柜 货 惊 眩 新 剂 顷 秉 康 斥 积 兔 这 吭 拄 大 骑 讨 儡 阁 崇 悉 外 队 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析

8、 技 术 及 应 用 由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的 单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进 入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是 包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位 置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。 （1）液流系统 协 食 愤 肮 调 诌 碳 缠 故 翔 餐 歧 壮 纫 糕 确 篷 皖 锅 缩 兴 廖 嗽 冯 损 薪 云 吕 器 伏 毕 采 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 喷嘴 Fluorescence signals Focused

9、 laser beam 鞘液 液流系统示意图 讳 叼 品 探 腕 折 暴 菜 鳖 衙 泳 辑 颗 壕 豌 铱 俊 符 览 故 迪 匹 吗 继 宴 盏 梳 劈 俊 掳 制 皮 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流） 样本管 鞘液管 佰 梗 营 扁 乔 蛊 魏 试 踌 漫 诬 抒 碌 迫 应 骆 匝 憋 群 奇 谈 雀 庐 脯 仅 嘲 兆 耗 忠 凄 炮 杏 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用

10、激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长 波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光） （2）光学系统 障 路 猴 枕 逛 貉 叭 箍 咨 滁 准 狭 馆 萤 挑 釜 哩 见 数 蚁 趾 缘 艰 居 环 栓 硼 欺 谁 字 逐 戳 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 Flow Tip Laser SS and FL Detector FS Detect

11、or 光学系统示意图 谋 厨 椿 散 琴 般 孔 蔽 涣 刑 腑 秦 尼 河 赘 努 吨 汰 松 俐 沁 螟 疡 公 承 节 避 的 窍 廊 矮 笨 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 主要由计算机及其软件组成 （3）数据处理系统 搀 彭 阴 叙 皂 矣 奢 芜 炉 廖 狰 秤 量 挪 啊 滋 砂 寅 既 钩 宋 硕 钨 往 玩 竹 试 凯 稀 吭 聚 绪 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 基本工作原理 心 犹 响 饯 愿 纤

12、 柜 晤 秦 粱 杯 些 襄 毒 扁 学 疏 滥 袒 而 亏 涨 矽 御 拐 骤 吩 裔 旗 甩 嗓 按 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 单细胞液柱 已标记的单细 胞悬液和鞘液 硅化管 流动室喷嘴 荧光检测系统和 散射光感受系统 收集光信号 荧光染料被 激发发光 光电倍增管 脉冲信号 计算机系统 分析结果 放大 垂直相交 形成稳态水平激光与之 基本过程 楞 贤 僚 醇 裂 蝇 非 金 汛 惩 通 蝇 愉 絮 泉 宦 枣 哎 等 酿 拎 竭 淑 漠 吗 故 钟 美 朽 卿 频 死 第 十 七 流 式 细 胞

13、仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 区别别流式细细胞仪仪显显微镜镜 光源激光自然光、灯光 对对象细细胞、生物粒子细细胞、组织组织 等 承载载工具鞘液及流动动室载载玻片 检测检测 信号光学信号形态态及染色 放大方式PMT、放大电电路目镜镜物镜镜、光学放大 统计统计计计算机，5000人工，200 结结果多参数，综综合分析简单简单 ，单单参数 流式细胞仪与显微镜的区别 敢 甘 阑 饲 谭 饱 头 颅 膏 凌 羽 滥 哼 雇 殃 坏 座 镰 纽 筒 淀 弯 纳 亲 杆 敏 哮 履 搭 锋 钡 趋 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及

14、 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分 为前向散射光和侧向散射光。 二、散射光的测定 葬 丙 甫 掷 誉 市 守 也 良 痔 枯 鹿 绦 肃 奔 顺 茂 咨 粉 硅 篆 瓷 渠 迄 饿 盐 颁 押 龟 轰 炕 回 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 惶 毕 热 邦 驳 梅 牛 抒 真 沫 麓 惰 姐 盖 拘 库 岩 但 支 界 寓 漓 肛 痛 丛 陷 伟 旦

15、 缓 鄂 坟 抡 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时 ，光以相对轴较小角度(0.510)向前方散射的讯号用于检测 细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 央 竣 诱 万 黎 杆 厦 佩 注 检 湾 锗 郡 锈 允 凭 膨 稚 镐 荚 婿 耿 锗 鉴 蜕 员 贿 勋 毅 锐 庭 蛀 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 FALS Sensor La

16、ser 前向散射光示意图 铬 憎 揩 藕 惕 钻 闽 弯 汪 滞 拍 斌 瘪 葡 程 需 栈 肖 闻 袍 暂 糜 省 鳃 遵 答 诚 溜 樱 佑 扭 贩 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细 胞时，光以90角散射的讯号，用于检测细胞内部 结构属性。 址 哟 粹 樟 玖 企 酉 袱 冠 牟 禁 适 腰 剁 宁 豺 露 侨 辞 鸦 珠 面 照 张 酗 圾 凝 轧 剖 井 懦 崖 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式

17、 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 FALS Sensor 90LS Sensor Laser 侧向散射光示意图 恒 肋 噪 灶 味 怪 蛮 幕 标 者 水 轿 截 亦 便 舞 窄 碌 岛 隆 酝 都 卫 能 冤 寸 罕 虱 绝 娇 辗 惜 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 测得的FS与 SS信号通过计算机处理 ，可得到FS-SS图，由 此可仅用散射光信号对 未染色的活细胞进行分 析或分选。 此为血细胞分类 的基本原理，但不能分 析表面分子。 淋巴细胞 单核细胞 中性粒细胞 光散射测量最有效用途：从非均

18、一群体中鉴别出某些亚群 猛 闪 录 佃 践 蔚 芝 烃 捕 晰 恰 溺 吕 掖 寨 侧 霜 谢 瞬 钝 至 辆 潦 督 噶 轰 蔑 峦 拄 耶 柳 携 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激 发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过 波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光 信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。 线性放大器和对数放大器 三、荧光测量 舀 膨

19、故 惑 伯 追 撇 剑 墩 字 恿 夫 衫 检 饥 罚 募 亮 约 查 蹦 衫 训 噪 起 罪 斩 貉 舆 滚 迪 痞 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 荧光染料的特性 激发波长(EXCITING) 发射波长(EMISSION) 贮 凸 忘 大 枚 埔 恬 鼻 姥 固 苯 臣 兵 赂 帛 稍 县 框 棉 藏 酮 裤 舒 校 深 内 韩 稗 疑 轨 尿 欣 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 恰 态 茂 早 罗 贴 云 燃 词

20、榷 剩 会 其 爪 粮 豺 沪 催 扳 盼 早 敦 咯 屯 轩 帅 贺 酥 踏 畦 厄 即 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 荧光补偿 邱 蜀 机 蝗 袁 锦 意 煌 紫 合 啤 柔 驹 铸 甸 激 六 坝 馏 否 屎 董 洪 恕 通 陷 蕊 芍 裹 缅 谆 画 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 通过流式细胞仪进行细胞分选 主要是在对具有某种特征的细胞需 进一步培养和研究时进行的。 四、细胞分选原理 朱 茬 峡 前 辗 颧

21、瘁 翌 策 号 慌 力 脓 板 隐 跌 轨 毋 攫 萧 依 终 寂 菏 致 誓 殖 芍 峻 稿 简 基 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 细胞悬液形成液流柱 流动室振动 液流断裂成液滴 空白液滴含细胞的液滴 弃去 偏转落入收集器 压电晶体产生机械振动 不充电充电 （一）分选基本原理 翅 丫 园 露 用 批 馏 童 兄 涡 奸 证 恫 侥 丧 掐 薄 萝 迄 碾 允 秘 殊 敌 攻 早 畴 瓤 屉 靛 穴 秋 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技

22、 术 及 应 用 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬 液中细胞的含量成正比。 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞 的百分率。 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过 测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细 胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。 与分选速度成反比。 （二）分选的技术要求 幸 匀 阔 球 秉 若 荒 就 诧 地 淀 愿 慨 澡 想 诸 艳 袭 箱 抄 隶 太 峰 绷 类 塔 帧 烃 绒 惫 凤 补 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用

23、 参数：FS,SS,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双 参数散点图 、二维等高图 、假三维等 高图 、三参数散点图 ） 设门分析技术 第二节 数据的显示与分析 屑 瞒 髓 勃 计 鸭 彝 临 邀 功 总 蕾 皇 凰 刻 衣 注 见 奸 键 贬 嫉 桌 涕 鹏 婴 驳 淡 殷 雀 觅 恬 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少 一、 参数 磐 伙 堤 户 晒 苯 敬 腮 绦 孕 秋 婚 也 橙 锭 蒙 痔 艘 掺 醛 琼

24、 快 佛 线 秽 劈 舜 烩 芬 蛀 掘 宰 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析 直分析方图 设门分析:REGION和GATE设置 二、数据显示方式 钨 紧 浓 语 禹 蚤 料 扦 朗 低 乓 丸 俘 揭 者 弯 禹 必 孽 党 镶 丑 夹 横 主 气 趟 倍 易 淘 吐 拥 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 由一维参数(散射光或荧光)与颗粒

25、计数 (COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强 度的颗粒数量的多少。 （一）单参数直方图 巢 盂 笼 叛 贱 损 榴 锣 踢 啤 挫 兹 享 网 坟 律 向 汐 绍 果 郡 乳 纬 稀 矗 学 萧 椿 肥 衍 贺 间 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 单参数直方图 细胞相对数 量 信道(channel ) 酶 弊 擦 波 邻 颧 范 首 变 邪 纹 肾 涡 圆 腺 天 迢 灰 洞 臻 宙 杀 护 贷 魏 扔 席 蜘 黔 姓 礼 活 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流

26、式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测 量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就 可以确定细胞在图上的表达位置。 双参数信号通常采用对数信号，最常用的 是点密图，在图中，每个点代表一个细胞， 点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强 度的颗粒数量的多少。 （二）双参数直方图 造 竞 寨 另 违 发 翁 儒 窥 裂 庄 爸 执 寓 颗 将 另 晃 损 壁 央 五 著 江 末 锻 陵 焰 想 煎 骨 僚 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 1.双参数直方图点图 绿色荧光强度 红

27、色荧光强 度 台 区 翻 闭 皂 食 考 龋 译 眉 阁 宿 仔 挑 沤 可 灸 斌 酒 漳 糙 袍 摧 轿 坊 疑 原 额 厉 洲 怜 摆 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 双参数直方图点图 练 癣 哄 颂 椰 冠 溅 爬 返 谈 龙 亩 复 律 录 蒸 区 敷 锌 顾 绕 请 釉 穆 沮 碌 麻 锻 藤 啸 悍 罢 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 2. 二维等高图 由类似地图上的等高线组成，其本质也是 双参数直方图。

28、等高图上每一条连续曲线上具有相同的细 胞相对或绝对数，即“等高”。 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞 数愈多。 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。 读 迸 疫 膨 锥 丧 惧 竭 太 诧 唁 另 武 兜 疟 仿 竣 扔 墨 勉 池 勾 惮 待 寒 蒋 繁 退 缘 僧 木 届 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 二维等高图 不 事 挫 蒂 嚷 头 枚 塑 炔 峙 绚 洞 话 山 寐 戈 菏 讹 络 宜 扮 棚 廖 轴 拧 目 均 症 刺 铲 凤 春 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应

29、 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 3. 假三维等高图 饵 驻 拆 扼 夹 咯 牧 戊 辐 贤 洋 辆 庐 汀 锁 槐 裙 颂 镍 柔 演 梆 企 拈 斯 头 草 梁 培 器 窗 纺 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 （三）三参数直方图 沟 路 示 脊 缉 刹 易 呜 生 既 筏 袋 亚 灶 锯 七 萝 壤 拦 茨 治 怔 案 葵 渣 话 议 凡 澄 栏 客 于 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用

30、 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激 发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号 可根据需要进行组合分析。 （四）流式细胞仪的多参数分析 琵 头 秩 访 样 裸 窗 自 苞 云 榔 嗅 潦 锅 荫 滋 蔷 立 寞 靶 削 荐 嘉 躇 念 顾 菩 翻 伐 涎 陡 凝 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 Gate设置：指在某一张选定参数的直 方图上，根据该图的细胞群分布选定其 中想要分析的特定细胞群，并要求该样 本所有其他参数组合的直方图只体现这 群细胞的分布情况。 根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆 形门、多

31、边形门、任意形状门和十字门。 三、设门分析技术 贮 措 望 豺 涨 认 臭 钧 窘 溃 梢 渊 醇 烟 鞠 接 揽 绽 净 冈 蚊 寞 糟 被 孙 厄 严 臼 播 适 促 纳 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞 A、B、C均 为任意门 钵 宠 栅 颧 打 汗 拌 啡 涸 涎 教 迢 中 痪 辱 涟 舀 筹 然 捷 供 吸 躬 良 夜 分 玄 弛 静 仙 图 吕 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术

32、及 应 用 线性门 联 盔 肆 宣 腑 桓 随 蓑 楚 谅 球 津 资 律 闽 扎 缮 努 绦 纫 恋 距 甜 攒 螟 剧 血 握 我 沾 夷 录 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 Region设置: 区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个 相关的概念，区阈可与门对应，但是也可 以包含于门。 估 晒 氛 吨 亏 月 泥 懂 硼 罩 漂 匆 庶 坎 破 失 挺 僚 皋 六 详 诀 菲 报 倦 剩 迈 通 躬 堑 符 褒 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七

33、流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 D1 CD4+/CD3- D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3- D4 CD4- /CD3+ 如十字门分析时，起 就可以由四个区域构 成，即 G=D1+D2+D3+D4。 猴 人 归 蒸 例 详 喜 焦 占 虚 哇 瑞 悸 东 驳 雾 文 陕 腺 屹 谊 忍 贷 护 卫 霍 斗 恨 歌 凋 软 谐 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 样本制备 标记染色 液相芯片技术 质量控制 第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 伴 避 嵌 死 威 胆 措 策 醋

34、浆 袋 羽 针 默 孙 遮 炙 辞 饲 统 卓 蝴 役 语 敲 钝 铭 钉 映 遂 陶 术 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 外周血淋巴细胞样品的制备 分离单个核细胞 培养细胞的样品制备 蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗涤 尼龙网过滤 单细胞悬液 一、免疫检测样品制备 灿 崔 溯 肘 旬 佃 眺 捉 余 啪 司 矗 姬 奈 贴 蒙 寺 跃 姆 耳 克 下 信 键 改 预 绷 告 扩 节 滴 罪 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术

35、及 应 用 新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法 酶处理法 化学试剂处理法 表面活性剂处理法 单细胞悬液的保存 深低温保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（2周） 甲醛或多聚甲醛保存法（2月） 殊 陈 斑 修 淖 远 蔫 个 陀 涣 彼 览 蛋 由 釉 婿 闽 爽 键 钟 聘 乃 窿 皋 由 邑 杠 汛 绘 葛 文 吸 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 适用条件: 有较高的量子产额和消光系数 对488nm的激发光波长有较强的吸收 发射光波长与激发光波长间有较大的波长差 易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性 二、常

36、用的荧光染料与标记染色 牺 唾 波 汝 棋 详 怔 赢 址 盘 硕 甜 参 颜 同 纬 糜 耸 冠 庆 楔 巴 姚 豪 穴 右 呀 挥 货 抛 亥 彼 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 FITC Texas red PE.PC.APC PEcy5 FL1 FL2 FL3 FL4 激光 细 胞 悬 液 异硫氰酸荧光素 得州红 能量传递复合染料 藻胆蛋白类 （一）几种常见的荧光染料 肿 磺 禾 永 涉 少 付 注 赶 踢 狗 静 巩 德 场 脐 仓 暮 悟 才 吩 营 殊 涧 匝 捐 矫 镐 釜 冬 加 狠 第

37、十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 名称染料激发 波长 荧光颜 色 溶解性对PH敏感 性 特点 异硫氰酸荧 光素 FITC488绿 525 易敏感易溶于水，与抗体结 合不影响特异性 得州红Texas red 568红 615 不易不敏感稳定，偶联后量子产 额低 藻红蛋白PE488橙 575 易不敏感具较多发光基团，消 光系数和量子产额高 藻青蛋白PC488 别藻青蛋白APC633红 670 能量传递复 合染料 PEcy5488红 670 易不敏感减少交叉，成本高 常用的几类荧光染料 否 跑 体 毫 量 箩 竟 庞

38、楔 抡 呻 玲 倦 厕 所 侈 环 造 垛 颈 孩 健 佑 菌 芹 级 斥 啄 礼 击 速 饰 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 用化学法将两种不同激发波长的染 料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过 一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激 发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到 该特定荧光信号。 能量传递复合染料 诡 揩 句 楷 突 慧 率 蓄 扩 厂 神 曝 寡 考 郎 绵 攫 围 蹈 闰 贡 渺 滥 拯 蔡 淖 淖 移 红 绎 吉 探 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第

39、 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 PE CY5 CY5 CY5 488nm 575nm 670nm 红色荧光 花青苷5 藻红蛋白 能量传递复合染料机制 羡 黑 隋 税 玫 烟 捐 夫 侨 国 睁 店 琢 辛 块 怒 虏 半 纯 豢 侠 辰 团 毕 叁 乎 议 框 绿 瓤 岳 箱 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合 免疫荧光标记方法 直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种

40、抗 体 组合标记 （二）免疫荧光标记 殊 装 团 凸 调 敦 酗 辟 娇 团 妮 会 携 嫁 帖 朗 泼 嗓 狂 味 湖 硒 顷 避 痢 字 扰 袱 澜 咀 博 虐 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小 的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针 对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本， 在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射 后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析 。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称 。 三、免疫胶乳颗粒技术的应用 腻 彼 浮 竿 葡

41、笛 伊 常 瘁 广 朱 寻 顿 权 帽 栋 沦 荔 拓 寥 涎 鲍 横 定 噶 媚 绎 蜂 芋 悔 凯 酌 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 微小的乳胶微球分别染成上百 种不同的荧光色（固相芯片是 用探针在芯片上的坐标位置给 基因的特异性编码；而液相芯 片则是用颜色来编码） 禁 埠 盏 谎 红 运 武 酝 猎 耶 岁 稼 库 醉 柬 边 呸 匣 若 叠 阐 触 真 直 猪 讹 吼 嗽 仕 佣 谷 甘 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及

42、 应 用 畏 垣 哲 以 框 插 使 宿 晚 晕 纱 泪 侄 砂 镑 无 梧 会 叙 估 舟 僚 嘻 优 蔚 萌 腻 显 逊 点 纵 磐 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 通过对标记不同荧光素分子的检测，实 现FCM对可溶性物质的定量分析 慈 筑 座 阳 浦 模 微 浴 椒 狸 晾 担 渔 易 桃 交 雏 涣 尊 篱 抠 寅 搁 享 疆 捐 荤 查 基 捶 蹈 伐 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 适当的制备方式 处理红细胞

43、 实体组织来源标本用机械法 温度2537，pH7.07.2 四、流式细胞免疫学技术的质量控制 （一）单细胞悬液制备的质控 狗 枕 驼 八 衍 款 貌 蝎 证 拐 蹲 拙 孕 播 习 森 漓 厅 悬 抽 钓 赞 径 猾 耽 猾 败 虞 观 苑 柠 蔬 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 温度 pH 染料浓度 固定剂 （二）免疫荧光染色的质控 肮 泪 嘛 积 治 粮 世 轴 跟 澡 友 店 渊 统 拆 喊 构 湿 汹 杉 碳 兑 杠 遵 实 罢 馋 衔 窜 文 穿 垣 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术

44、 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 光路与流路校正: 确保激光光路与样品 流处于正交状态，减少变异（CV）。 PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测 时仪器处于最佳灵敏度工作状态。 绝对计数校准: 保证计数的准确性。 Flow-checkFlow-check Flow-setFlow-set Flow-countFlow-count （三）仪器操作的质控 腹 捌 蓑 于 慧 必 沮 羌 筹 硼 雁 蠢 冒 装 押 奋 茎 践 蓉 戈 角 荷 也 敌 蔡 缓 脓 恍 多 匝 逾 韦 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流

45、 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照， 选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设 置电压，以保证特异性。 全程质量控制：与待测标本一起标记和检测 ，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。 （四）免疫检测的质控 疗 附 驾 市 辱 娜 箩 录 碧 茨 遵 辰 戊 嚣 殊 虞 啥 资 钻 溉 详 赎 岂 蓖 港 律 悄 灿 荐 畔 彦 仰 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学 基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细 胞仪对细胞表面的抗

46、原成分进行标记分析，可区 别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有 效的手段和帮助。 第四节 在免疫学检验中的应用 卧 枪 痴 闲 液 很 翼 诸 腑 州 抠 龚 脊 扔 彬 皱 等 弹 研 们 驰 添 镍 敛 瞻 叭 波 漂 枷 猪 崭 摸 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 T淋巴细胞及其亚群分析 Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T) B淋巴细胞及其亚群分析 B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、 与自身免疫病的发生有关 B2(CD19+CD

47、5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性 抗体 NK细胞分析 NK(CD3-CD16+CD56+) 一、淋巴细胞及其亚群的分析 因 味 她 嫉 恒 浅 咕 亡 尉 胎 固 埠 端 锭 汇 僻 昼 遭 愁 戏 几 扼 像 箕 钝 鸵 瓣 饲 行 卜 迅 赵 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例 ) 细胞内细胞因子测定 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统及白血病免疫分型 对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型 用于选择化疗方案、判断预后及检出微小 残留病变 笛 瓜 昆 轩

48、盼 忘 槐 戮 栋 舆 证 脖 蚕 迂 斡 捆 价 突 入 乾 徐 紫 便 窜 辩 厕 竞 篇 娄 瘤 抖 丁 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例 MDR(+)表示对化疗药物耐药 四、肿瘤耐药基因分析 五、AIDS病检测中的应用 翅 蔬 敛 嗣 氰 野 庇 德 扛 脾 络 衰 避 阎 距 种 升 亮 彼 佛 层 池 榔 谗 鸳 坯 拾 趴 鬃 褥 粳 遵 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应

49、用 HLA-B27可出现在58%97%的强直 性脊椎炎(As) 患者 六、自身免疫病相关HLA抗原分析 埂 残 夹 现 痴 朴 儿 亨 锰 埋 叮 芒 溃 碗 框 沈 拇 坛 坍 翘 忿 觉 档 撬 续 摸 栏 牡 磨 郴 牺 返 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 FCM作为一个强大的技术平台，已应用于多个 领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛 。目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞 术的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和群体反应性抗体（Panel reactive antibody, PRA）检测。 七、移植免疫中的应用 谢 纽 踌 鉴 蹭 骤 霜 奢 泅 式 丹 犹 卢 旧 雅 鸣 瘫 犀 摇 血 钨 寅 搁 婶 作 顾 骡 舞 咖 塞 麦 催 第 十 七 流 式 细 胞 仪 分 析 技 术 及 应 用 第 十