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1、2种绿藻的玻璃化冻存研究收稿日期：2016-05-31 基金项目：国家自然科学基金（编号：30960215）；广西自然科学基金（编号：桂科青0728019）；广西民族大学相思湖青年学者创新团队资助项目。 微藻结构简单、繁殖迅速、易于培养、能够产生多种生物活性物质，具有很好的开发前景。藻类的长时间培养容易引起藻种污染，生命力减退以及藻种的基因漂变1-2，给藻种的保存、研究以及大规模培养带来众多不便。目前，在微藻保存中的方法有固定化保存，继代保存和超低温冻存法3。这些方法在实际应用中有其弊端，如继代培养在多次接种过程中藻种容易污染和逐渐老化，生命力减退。固定化保种程序复杂，大多数微藻在培养后期常会
2、从胶珠中溢出4-5。自1985年Rall等首次将小鼠胚胎细胞运用玻璃化冻存的方式成功冻存6以来，玻璃化冻存的应用越来越广。玻璃化冻存技术不仅可以克服在藻种多次接种下导致的污染、基因漂变问题，还可以在超低温条件下杀死有害细菌，实现藻种长期保存的目的7。微藻玻璃化冻存的成功报道也越来越多8-10。小球藻（Chlorella）具有很高的营养价值，胶网藻（Dictyosphaerium）产油脂量较高，对它们进行成功低温保存将为进一步开发利用这2种绿藻奠定基础。本试验对胶网藻和小球藻的玻璃化冻存进行了研究。 1材料与方法 11藻种来源及其培养 胶网藻HE01与小球藻HE07分离于广西沿海红树林的水样中。
3、2种绿藻培养于F2培养基中，在（241）、光照度（440 W日光照射）、光暗周期为12 h12 h的条件下培养。取对数生长后期的藻液用于试验。 12抗冻保护剂的选择 JP3在蔡小宁等的试验方法11上做出改进，选取10% DMSO+10%乙二醇+30%蔗糖+F2培养基为玻璃化冻存液配方。分别在此基础上改变DMSO、乙二醇与蔗糖浓度。DMSO浓度梯度为5%、10%、15%、20%、25%；乙二醇浓度梯度为5%、10%、15%、20%、25%；蔗糖浓度梯度为10%、15%、20%、25%、30%。在单因素优化结果的基础上进行3因素3水平的正交试验，正交试验选用浓度为单因素优化最佳值与左右相邻值。 1
4、3玻璃化冻存 131预处理 将对数生长期的2种藻细胞置于4 的环境下暗培养48 h。提高藻种的耐寒性。 132预平衡 取预培养后的藻细胞4 mL，经离心浓缩后分别加入稀释2倍的玻璃化冻存液和培养基预平衡5 min，离心去除平衡液，迅速加入玻璃化冻存液或培养基分装到2 mL的冻存管中，每管500 L。 133冻存步骤对微藻冻存率的影响 分别将2种藻迅速放入到液氮罐中或者在4 冻存30 min后，移到-20 冻存2 h再移到-80 条件下过夜后投入到液氮罐中。 134解冻和冻存液的去除 将在液氮中保存24 h后的藻种取出，立即放入40 恒温水浴锅快速解冻。化冻后的微藻在无菌条件下室温平衡20 mi
5、n后加入3倍体积培养基离心去除溶液，用培养基重复洗涤23次。 135冻存后的恢复培养 将去除冻存液的藻细胞接种到新鲜培养基中，暗培养1 d后转入到光照培养。 14藻细胞存活率的测定 参照Canavate等的方法12，取恢复培养后的藻细胞接入F2培养基，培养4 d后，采用752型紫外分光光度计测定藻液的D680 nm值。并以未冻存的藻细胞作对照。 存活率=解冻后藻液的D680 nm值未冻存藻液的D680 nm值100%。 2结果 21蔗糖浓度对冻存率的影响 未加入冻存液的2种藻的存活率均为0，可以看出2种微藻对超低温均没有耐受性。随着蔗糖的浓度增加，2种海洋绿藻的存活率显著增加。当蔗糖浓度达到2
6、5%的时候存活率最高，HE01为6375%，HE07为6036%（图1）。 22DMSO浓度对冻存率的影响 当DMSO浓度为10%的时候2种绿藻冻存率最高，HE01和HE07冻存率分别为616%、5526%（图2）。这一结果与蔡小宁等的研究11相符。一般认为，DMSO的高极性使其易于透过细胞膜，并在细胞内外形成高渗透压，因此DMSO穿透能力较强并且具有更好的保护效果，防止细胞内形成冰晶导致细胞膜被破坏13。 23乙二醇浓度对冻存率的影响 乙二醇可迅速渗入细胞内，降低细胞膜对水的通透性。试验结果表明，乙二醇在浓度为10%的时候海洋微藻冻存率最高，HE01和HE07冻存率分别为6127%、6144
7、%（图3）。 24正交试验结果 玻璃化冻存液试验因子对2种海洋微藻的的存活率有明显影响（表2、表3、表4）。影响存活率的因素主次顺序是：DMSO浓度蔗糖浓度乙二醇浓度。根据k值可以得到适合HE01的最佳玻璃化冻存条件为5% DMSO+15%乙二醇+25%蔗糖+F2培养基。通过冻存试验HE01的存活率为702%，高于正交试验中的存活率。适合HE07最佳玻璃化冻存的条件为15% DMSO+15%乙二醇+25%蔗糖+F2培养基，由正交试验可以看出存活率为7059%。因此，综合考虑HE01的玻璃化液最优组合水平为5% DMSO+15%乙二醇+25%蔗糖，HE07的玻璃化液最优组合条件为15% DMSO
8、+15%乙二醇+25%蔗糖。 25冻存步骤对冷冻保存存活率的影响 相较于未分步冻存的HE01存活率为556%， 分步冻存的HE01存活率提高为672%（图4）；经过分步冻存的HE07存活率为689%，高于未分步冻存414%的存活率（图5）。反映出充分的预冻处理是保证玻璃化冻存的成功条件之一。 FK（W11TPLHQ4tif 26冻存后2种绿藻的生长情况 冻存后恢复培养的2种绿藻细胞其生长曲线测定结果（图6、图7）表明，冷冻组与对照组的生长规律一致，在生长前期，冻存的细胞生长较慢，但在对数后期，冻存组的活性恢复，生长速度和对照组差别不大。 FK（W11TPLHQ6tif 3讨论 影响微藻低温冷冻
9、存活率的因素有很多，包括冷冻剂、藻种、冷冻步骤等等14。针对不同的藻种，也要对其玻璃化冻存液进行特定的优化。将不同的冻存保护剂联合使用进行玻璃化冻存，可以使防冻剂的液体黏滞度升高，液体分子的弥散运CM（25动被抑制，从而加强冷冻效果和减轻毒性。DMSO、蔗糖、 FK（W11TPLHQ7tif 乙二醇是最常用的抗冻保护剂。蔗糖可以限制水分过快进入细胞，为细胞提供一个高渗环境，增加抗动力的同时又充分脱水，避免冻存时冰晶形成造成伤害，也避免解冻时发生渗透性休克，起到特异性保护作用15。结果表明在所示的浓度范围内，蔗糖浓度越低导致微藻存活率越低。乙二醇与DMSO都是常见的渗透性冷冻保护剂。乙二醇可迅速
10、渗入细胞内，降低细胞膜对水的通透性。DMSO的高度水溶性使其易于透过细胞膜并形成高渗透压，补偿了细胞内外存在的盐梯度，因此可防止细胞内的冰晶形成和细胞膜的破坏。但DMSO具有一定的毒性，能导致部分细胞死亡。闫立强等发现，DMSO对微藻的毒性大小既与微藻种类有关，也与DMSO浓度有关16。如图2所示，随着DMSO浓度由10%逐渐增加，2种微藻的冻存率也越来越低。这是因为高浓度的DMSO对微藻有较大毒性，导致了微藻细胞的死亡。10%浓度的DMSO是介于微藻细胞毒性与细胞保护之间的一个临界点。不同的微藻由于细胞壁的不同对冻存剂的耐受力不同，导致每种微藻的抗冻保护剂不同。在冷冻过程中，常将几种保护剂混合起来使用，既保证了抗冻性也降低了单一保护剂高浓度的毒性。 在做预处理时冷冻保护剂与细胞接触的温度和时间需要进行严格控制，试验结果表明进行预冻存处理效果好于将藻种直接投入到液氮当中。因为低温环境可以降低DMSO的毒性17，同时细胞与冷冻保护剂预先接触可提高细胞对渗透压突变的耐受性。通?控制海洋微藻冻存的内外条件，本试验冻存的2种海洋绿藻，存活率都达到了66%以上。 玻璃化冻存法研究虽然取得了一定的进展，但是适合于一种藻种的方法对另一种藻可能并不适用。针对这一领域，还有许多问题需要做进一步的探讨与研究。如微藻化冻后的材料处理，活化复苏培养所需的条件18，抗冻性与细胞年龄等，有待更深入的研究。