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1、Race方法克隆云芝免疫调节蛋白基因云芝是最具药用价值的真菌之一。其又被称为白芝或彩绒革盖菌，在分类学上属于真菌门、担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、云芝属。最新的研究表明，云芝中主要活性成分除了云芝多糖，云芝免疫调节蛋白也发挥了重要的作用。真菌免疫调节蛋白是小分子蛋白质，来源于高等担子菌的子实体，能够抗过敏反应、加强核酸和蛋白质的合成、提高淋转效率、提高机体的免疫功能。随着对真菌生物功能蛋白研究的日益深入，真菌免疫调节蛋白已成为学者研究的重点内容。 基于以上，本研究采取race方法，从云芝中克隆出云芝免疫调节蛋白，为真菌免疫调节蛋白基因克隆的研究提供新的方法。为进一步开发真菌资源提供基础的研究数
2、据。 1 实验材料和试剂 1.1 实验材料 云芝（Coriolus versicolor），购自于吉林农业大学菌物研究所。 1.2 菌种 细菌菌株 E.coli DH5为本实验室保存。 1.3 实验试剂 DNA Marker等购自于大连宝生生物有限公司；其他生化试剂均为国产分析纯。 1.4 培养基 YPG培养基：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，葡萄糖 20g/L（或麦芽糖15g/L），MgSO40.5g/L，KH2PO41g/L。配制固体培养基时加琼脂粉15g/L。110高压灭菌30min。 2 实验方法 2.1 云芝菌丝体的培养 在无菌条件下，将云芝菌种用接种针挑取一小块菌丝体接
3、种于液体YPG培养基中，在25培养箱中震荡培养57d。 2.2 云芝免疫调节蛋白基因的克隆和表达载体的构建 2.2.1 云芝基因组总RNA提取 无菌水洗菌丝体，用液氮预冷研钵，在液氮中研磨菌丝体至细粉状，转入1.5mL离心管中，加入500L提取液； 继续加入1mlRNAisoReagent； 将上述研磨好的粉末加入以上离心管中，轻轻混匀，离心（12000rpm，5min）； 吸取上清，放入一个新的离心管中，向其中加入200L氯仿，混匀，离心（12000rpm， 15min）； 吸取上清，加入等体积异丙醇，充分混匀，在1530静置20min，离心（12000rpm，10min）； 弃上清，加入1
4、mL75%的乙醇，上下颠倒，12000rpm，离心（12000rpm， 5min）弃乙醇； 干燥沉淀25min（室温），加入50L的RNase-free水使 RNA完全溶解，置于-80保存备用。 2.2.2 云芝免疫调节蛋白（Fip-cve）基因的克隆 2.2.2.1 中间片断的获得： 以赤灵芝（G.lucidum）Fip-glu基因序列（GenBank No：M58032）为基础，设计同源引物P1和P2，来完成云芝同源区域中间片断的克隆。引物序列为： P1：5TGACCGACAAGGCGTACACGTAC3 P2： 5acctggatcgtgttcgtgtccg3 反转录反应体系：10L体系
5、，1.0L dNTP，0.5L Primer oligodT，0.25L RNase inhibitor，1L10RT Buffer，2.75LRNase Free H2O，2L MgCl2，2L RNAsample 0.5L AMV。 程序为：3010 min，4230min，995min。 PCR反应体系：50L体系，包括0.25LTaq酶，5L PCR buffer，1L dNTP（2.5 nmol/L），1L引物A（20 nmol/L），1L引物B（20 nmol/L），模板DNA 1.5L，ddH2O 40.25L。 反应程序为：（94预变性5min，9410s，55 20s，723
6、0s，共31个循环， 然后725min）。凝胶回收扩增产物，将产物连接于pMD18-T载体，转化大肠杆菌，提取质粒后测序用于下一步。 2.2.2.2 3 RACE程序 根据上述片断的测序结果，设计上游引物P3，用于3 RACE，引物序列为：P3 ：5、ACCTCGGTGTG-CGCCCCTCATACGC 、3反转录反应体系：10L体系，包括2L MgCl2，1L 10RT Buffer，2.75L RNase Free H2O，1.0L dNTP，0.25L RNase inhibitor，0.5L AMV，0.5LPrimer oligodT，2L RNA样品。 PCR反应体系：50L体系，
7、包括1LdNTP（2.5 nmol/L），0.25LTaq酶，1L引物E（20 nmol/L），5L PCR buffer，模板DNA 5L， 1L adaptor primer（Kit primer），ddH2O 36.75L。 反应程序为：（94预变性5min，9420s，5730s， 7240s，共31个循环， 然后725min）。凝胶回收扩增产物，将产物连接于pMD18-T载体，转化大肠杆菌，提取质粒后测序用于下一步。 2.2.2.3 5 RACE程序 以3 RACE序列、中间片断的序列信息为依据，继续设计5RACE引物，引物序列如下： P4：5，acgacgacacggtacgtgt
8、acgcc，3 P5：5，TCCAGGTGTACGTCATTGACCCCG， 3 首链cDNA的合成： 反转录体系如下：1.5L10RT Butter，0.5LRNase Inhibitor，1LAMV Reverse Transcriptase XL，1L5端磷酸标记反转录引物F，5L总RNA，再加入RNase Free dH2O至总体积15L。反应条件为30反应10min，50反应1h，995min。 单链cDNA环化：向干燥的单链cDNA中加入12L的dd H2O 和8L的5RNA（ssRNA）Ligation Buffer溶解，继续加入20L的40%PEG6000均匀混合，再加入1LT
9、4 RNA Ligase，16反应24h。 PCR反应：取上步反应液5L作为模板，加入0.25LLA Taq酶，5L10x LA PCR buffer，2.5LdNTP （2.5 nmol/L），1L引物I， 1L引物J。 反应程序为：同上，凝胶回收扩增产物，将产物连接于pMD18-T载体，转化大肠杆菌，提取质粒后测序用于下一步。 3 实验结果 3.1 云芝菌丝体的培养 挑取云芝菌丝体适量，取250mLYPG液体培养基中，在超净工作台中接种，摇床震荡培养（26，110转/min，培养7d），培养后可见质量比较好的球状菌丝体，结果如图1所示。 3.2 云芝免疫调节蛋白基因的克隆 提取云芝菌体总R
10、NA，总RNA的电泳图谱结果如图2所示。以此作为反转录模板，根据赤灵芝（G.lucidum）Fip-glu基因序列在GenBank中同源保守区序列，设计引物P1和P2来克隆中间片断。PCR扩增出160bp长度左右的片断，结果如图3所示，回收纯化以上的目的片段，连接于pMD18-T载体，用大肠杆菌DH5转化，送测序公司对结果进行测序。根据测序结果设计3RACE正向引物来进行3末端的克隆，3RACE扩增出250bp的片断（结果如图4所示）。根据以上测序信息设计5RACE引物来进行5段序列扩增，5RACE最终扩增出300bp左右长度的序列（结果如图5所示）。最终将这四段序列进行拼接形成完整的Fip-cve基因基因全序列，序列长度为481bp，全序列结果如图6所示。 4 实验结论 真菌免疫调节蛋白（Fip）是真菌中重要的药理成分之一。本研究利用race方法成功的从云芝中克隆了云芝免疫调节蛋白基因 Fip-cve，基因片段长度为481bp。