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1、STAT3蛋白真核表达载体的构建及其泛素化功能研究化5。信号转导与转录激活因子家族（STAT）已发现7个成员，STAT3是该家族的研究热点，且敲除该基因可以使胚胎死亡，说明该基因是不可或缺的。磷酸化修饰是调控STAT3活性的主要方式，Tyr705、Ser727是磷酸化的关键氨基酸位点6。此外，STAT3的Lys685可以在组蛋白乙酰转移酶的修饰下发生可逆乙酰化7-8。 在真核细胞中，蛋白质的泛素化和磷酸化是最常见的翻译后修饰。细胞外信号严格调控着蛋白的泛素化，在很多情况下，这种调控依赖于蛋白质的磷酸化9。磷酸化通过修饰泛素化的底物，或者修饰泛素化机器的某个组分来影响泛素化。此外，泛素化对于磷酸
2、化和信号分子的传递也有一定的作用。本研究通过研究STAT3蛋白是否会发生泛素化，发生哪种类型的泛素化，并以此解释泛素化与STAT3活性之间的关系。 1材料与方法 1.1试验材料 Taq DNA polymerase，购自北京鼎国生物技术有限公司；T4 DNA连接酶、pMD-19-T simple Vector、DNA酶、Oligo（dT）18、Random promers、PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）Kit，购自TaKaRa公司；dNTPs，购自北京盛旭百川生物科技有限公司；DNA分子量标准
3、品，购自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；蛋白质非预染分子量标准marker及预染分子量标准marker，购自Fermentas公司；Tween-20，购自Amresco公司；质粒小量提取试剂盒、EASYspin plus RNA提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；质粒大量提取试剂盒、Enhanced chemiluminescence（ECL）kit，购自北京康为世纪生物科技有限公司；DNA凝胶回收纯化试剂盒，购自Zymo公司；无内毒素大量质粒提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；Anti-c-HA单克隆抗体、protein A/G plus-agarose（SC-2003），
4、购自Santa Cruz生物公司；Anti-FLAG M2（F1804）单克隆抗体、PI染料，购自Sigma公司；HRP-标记山羊抗小鼠和山羊抗兔抗?w，购自北京鼎国生物技术有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂，购自Invitrogen公司；蛋白酶抑制剂，购自亚太恒信生物科技（北京）有限公司；Sal 和Hind 酶，购自NEB公司；HA-ub、HA-KO、HA-K48、HA-K63等载体质粒均由唐军教授馈赠；所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.2Human STAT3基因的克隆 根据NCBI STAT3（ID：47080104）基因序列设计引物，上游引物为
5、5-ATGGCCCAATGGAATCAGC-3，下游引物为5-TCACATGGGGGAGGTAGCGC-3。建立50 L PCR反应体系：5 L 10PCR Buffer，2 L 10 mmol/L dNTPs，20 pmol/L 上下游引物各1 L，4 L cDNA，1 L Taq plus DNA polymerase，用ddH2O补至50 L。按以下程序进行PCR反应：94 预变性5 min，进入循环：94 变性30 s，60 退火45 s，72 延伸2.5 min，共35个循环；72 延伸10 min，4 保存。1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物，目的基因大小为 2 313 bp。 1.
6、3宿主细胞蛋白STAT3重组质粒的构建 针对pRK5-flag质粒多克隆位点设计引物并引入Sal和Hind酶切位点，以测序正确的pMD-19-T-STAT3质粒为模板进行PCR；1.5%琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物后，进行Sal和Hind双酶切，同时对pRK5-flag质粒进行 Sal 和Hind双酶切，1.0%琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物；将PCR酶切产物和pRK5-flag酶切产物按6 1摩尔比混合，并加入等量的（5 L）Solution I（酶溶液），过夜连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5；挑取单克隆，提取质粒酶切鉴定正确后，由北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，测序正确克隆保存菌种，
7、并提取质粒待用。 pRK5-flag-STAT3：上下游引物分别引入Sal和Hind酶切位点，上游引物为5-ACGCGTCGACATGGCCCAATGGAATCAGCTAC-3，下游引物为5-CCCAAGCTTTCACATGGGGGAGGTAGCGCAC-3。 1.4STAT3泛素化的检测 6孔板分别按下述方式转染HEK293T细胞，其中pRK5-flag空载体组作为阴性对照：（1）pRK5-flag+HA-ub；（2）pRK5-flag-STAT3+HA-ub；（3）pRK5-flag+HA-KO；（4）pRK5-flag-STAT3+HA-K48；（5）pRK5-flag-STAT3+HA-K63。