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1、一种单分子操纵DNA-组蛋白复合物的新方法关 键 词：-DNA; 组蛋白; 原子力显微术; 拉直 JIAO Zhuo-feng, MA Qiu-mei, WANG Yan-wei, RAN Shi-yong, YANG Guang-can* (College of Physics and Electronic Information Engineering, Wenzhou University, Wenzhou 325035, Zhejiang Province, China) A new method of aligning -DNA-histone complexes at the si
2、ngle molecule level. Journal of Zhejiang University(Science Edition), 2011,38(1):038-040 Abstract: This paper described a new method of straightening -DNA-histone complexes on mica surface. The atomic force microscopy imaging of the samples indicated that we can not only straighten bare -DNA effecti
3、vely and well, but also -DNA-histone complexes, of which the concentration of histone varied by using this method. This method can be employed in transcription process of DNA and DNA-protein interactions at the single molecule level. Key Words: -DNA; histone; atomic force microscopy; aligning 近年来，拉伸
4、DNA已成为研究DNA的一个重要手段，而原子力显微术(AFM)则极大地方便了对单分子DNA的观察.人们已发明许多方法来拉伸DNA分子:原子力显微镜微悬臂法1、光镊2,3、磁镊4,5、旋转法6、液流法7、吹气法8和分子梳技术9等.但目前以上方法只应用于拉伸DNA分子，极少应用于拉伸DNA与组蛋白的复合体.组蛋白是一种很重要的蛋白质，对DNA分子的压缩起着重要的作用，在一定范围内它可以使DNA分子折叠成更加有序的高级结构.活细胞或噬菌体中的DNA分子都以紧密堆积的形式存在，其体积仅仅是自由分散状态的10-410-6，这种结构不仅具有所占空间较小的特点，而且与基因表达的自我调控密切相关,因而具有重要
5、的生物学意义.真核生物中,形成染色质时组蛋白与DNA紧密结合.作者借助于原子力显微镜对DNA与组蛋白的结合能力进行了初步研究，实验中，对DNA-组蛋白复合物进行了拉直操作，并对其他浓度组蛋白的DNA溶液进行了研究.通过研究被拉直的DNA分子吸附的组蛋白数量，可以得知组蛋白浓度变化对二者相互作用的影响，这有助于在单分子水平上研究DNA-组蛋白的相互作用.另外,由于DNA与组蛋白两者均为生物大分子,它们之间的相互作用非常复杂,影响的因素也很多.本实验提供了一个研究这些相互作用的出发点，将有助于弄清通常很长的DNA分子(例如,人的DNA分子展开后的长度近两米)是通过哪些机制被折叠的.目前,从物理学的
6、视点上对这一问题的理解仍具有挑战性，是一个值得从理论和实验两方面深入探讨的悬而未决的科学问题. 1 材料和方法 1.1 试 剂 实验过程中超纯水电阻率18 M•cm. -DNA(48,502 bp)购于NEB公司，3-Aminopropylrtiethoxysilane(APTES)和组蛋白购于Sigma公司. 在实验时，采用TE(10 mmol•L-1 Tris-HCl, pH 8.0, and 1 mmol•L-1 EDTA)作为缓冲液来稀释-DNA.本文实验中DNA质量浓度均为1.5 ng•L-1,DNA-组蛋白混合液先配制好，室温下培育2
7、4 h以上待用，组蛋白浓度则根据需要调节. 1.2 云母表面处理 实验中，采用APTES处理的云母来成像复合物10-11.APTES处理云母过程如下：首先取质量分数为1%的APTES水溶液约30 L滴在新解理的云母表面，放置约15 min，用超纯水冲洗约5 min，氮气吹干，然后120 高温加热30 min，冷却后干燥器中待用. 1.3 拉直处理 第一步：将约20 L DNA-组蛋白复合物滴在APTES处理过的云母片上（由于疏水缘故，小液滴呈现小珠状），样品沉积在云母表面约5 min，用镊子夹着云母片与桌面成45度角，氮气朝液滴上方与云母成较小角度吹液滴，液滴便会沿着表面慢慢向下移动，最终吹离
8、表面. 第二步：接着用移液器滴约20 L纯水在云母上，用移液器枪嘴稍微接触液滴的边缘，按照第一步中液滴移动的方向慢慢吸走样品，如此重复20次左右，氮气吹干，干燥.对于裸DNA的拉直也按此操作. 1.4 仪器表征 原子力显微镜12为SPM-9600（Shimadzu, Kyoto, Japan），针尖购买自Nanoworld,力常数为42 N•m-1，样品在室温下以Tapping mode在空气中成像，相对湿度为30%40%.所有图像采集的扫描速度为23 Hz，像素为512512，所有图片只经过平滑与去噪声处理. 2 结果和讨论 因为云母具有原子级平整度的表面，而被广泛用来作为原子力
9、显微术样品的基底.生物样品如DNA、蛋白质等，都可被吸附在云母表面较好成像.作者利用APTES处理过的云母片，根据材料和方法中的操作方法，首先对裸-DNA进行了拉直操作.图1为-DNA在云母表面的拉直形貌.-DNA浓度均为1.5 ng•L-1,图1A为放大的拉直的单根-DNA，图1B为范围较大的拉直的多根-DNA.图1B中多根DNA分子链被并列地排列，表面较干净清晰，成像效果较好.如果在对样品拉直时，只做第一步，那么成像图像表面非常粗糙以致难以较好观察到DNA分子.第二步用纯水洗涤，可以洗掉云母表面所形成的盐和未吸附牢的样品10.所以在实验时，两步骤都不可避免,这样才能清晰成像拉直
10、的DNA. 对于裸DNA的拉直已有较深入的研究，而对结合有组蛋白的DNA拉直却鲜有介绍.基于此，作者对-DNA-组蛋白复合物在云母表面的拉直进行了尝试.在这里-DNA质量浓度为1.5 ng•L-1，组蛋白浓度为34 nmol•L-1.图2中笔直的线条为拉直的-DNA分子，线条上白色的圆点为DNA-组蛋白复合体.通过拉直，可以方便做很多工作，如测量DNA长度，找到DNA-组蛋白结合位置，统计两者的结合数量等. 文献13曾报道，通过荧光显微镜观察到当组蛋白浓度很大时，分子梳技术很难把DNA-组蛋白复合物进行完全拉直.用笔者的方法也对高浓度组蛋白情况下的DNA进行了研究.如图
11、3所示，DNA被较好地拉直在云母表面.其中DNA质量浓度为1.5 ng•L-1,组蛋白浓度为40 nmol•L-1.笔者试着做更高浓度的组蛋白与DNA复合体研究，然而组蛋白浓度太大而导致云母无法吸附DNA.图中白点表示DNA与组蛋白形成的复合体，与图2相比，图3中复合体密度要大得多.实验结果也表明，组蛋白与DNA的结合数量会随着组蛋白浓度增加而增加.组蛋白的参与会引起DNA发生一定程度凝聚14，要对DNA进行拉直必须克服这种凝聚力.虽然未能在更高浓度组蛋白存在的情况下对DNA进行拉直，但是，当组蛋白浓度在一定范围内时，此方法对DNA的拉直效果还比较好. 因为DNA分子链
12、越长越倾向于缠绕在一起，对DNA分子链的部分拉直相对容易，然而要想把整个长的DNA拉直却是一个挑战.因为在对DNA分子链拉直时，DNA所受到的外力要刚好适宜.太小的力不能较好拉直DNA分子，而太大的力很容易使DNA断裂.这里笔者对附着有组蛋白的-DNA链进行了一些尝试（见图4）.图4由两张图片合成，显示同一根-DNA被较好地拉直在经APTES处理过的云母表面，DNA链上附着的白点为-DNA-组蛋白复合体.通过测量知DNA长约9 m，而-DNA原长约为16.4 m.文献13指出，组蛋白的结合会使-DNA表观长度减小，结合的蛋白数目越多，DNA长度也会缩短得越多.这里一方面由于组蛋白引起DNA长度缩短，另一方面也不排除-DNA链被部分拉断，图中所观察到的只是整个DNA链的一部分.因此从不严格意义上说，此方法基本能拉直整个-DNA分子. 3 结 论 此方法操作简单，重复性较好，结合了文献8与15的优点，是两种方法的有效结合.利用此方法首先对裸-DNA在APTES处理的云母表面较好成像，接着也成功拉直了-DNA-组蛋白复合物.结果表明只要组蛋白浓度在一定范围内时，-DNA就能较好被拉直，且成像清晰.此方法是对DNA拉直技术的丰富与发展，利用此方法可以在单分子水平上研究DNA的复制、转录过程以及DNA-蛋白质相互作用.