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1、不同哺乳动物密码子偏性及聚类分析在雌性哺乳动物整个生殖周期过程中，卵母细胞只能来源于原始卵泡库1。有研究表明，原始卵泡形成过程受激素、转录因子和相关通路的介导2。生长分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF9）作为转化生长因子超家族成员之一，在卵泡的发育过程中有关键的调节作用3。密码子是DNA或RNA的碱基序列与其编码蛋白序列之间的对应关系4。编码相同氨基酸的密码子为同义密码子，在蛋白合成过程中，同义密码子的使用频率存在差异，且物种和基因对某一种或几种密码子的使用具有偏好性5。对基因密码子偏好参数进行分析，能更好地理解和研究基因水平转移和基因家族分化的
2、发生6。因此对密码子偏好性的研究可在分子的角度为GDF9基因序列特征、分类和遗传进化规律提供重要信息。前人相关研究表明，GDF9基因具有刺激颗粒细胞减数分裂、抑制素的生成作用7，并影响卵泡发育和生殖功能8。Wang等发现通过siRNA敲除GDF9后能抑制仓鼠原始卵泡的形成，但添加GDF9纯品培养卵巢会加速原始卵泡的形成9。在人、啮齿类、牛、绵羊和有袋类动物卵巢卵母细胞中，GDF9基因特异性表达，但该基因在山羊卵母细胞和黄体中可同时表达10-11。GDF9基因还能通过多个信号通路促进颗粒细胞增殖过程12。马会明等通过RNA干扰使该基因表达沉默，也能抑制颗粒细胞增殖过程13。这些研究通过探讨不同哺
3、乳动物已被克隆的GDF9基因，并在卵巢卵母细胞中进行了相关表达分析，但未开展密码子使用偏性的研究，这不利于其异源表达和遗传转化等后续试验的进行。GDF9基因密码子使用偏好性的研究能为该基因的分类和进化提供重要信息。本研究利用CodonW软件分析不同哺乳?游?GDF9基因对密码子的使用情况，基于GDF9基因最小进化法和同义密码子相对使用度的欧式平方距离系数建立聚类关系，为GDF9基因功能的深入研究提供参考依据。 1材料与方法 1.1目的基因的来源 本研究所用基因资料都来源于Nucleotide（https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）数据库，12种物种包括灵长目
4、苏门答腊猩猩、普通狨猴和人，食肉目家猫和家犬，偶蹄目家牛、牦牛、绵羊、山羊和野猪，啮齿目小家鼠和褐家鼠。各哺乳动物GDF9都是完整的cDNA序列（表1）。利用MEGA 6.0对上述核苷酸序列进行碱基分析。 1.2目的基因的筛选 对候选的哺乳动物GDF9基因cDNA序列进行如下规则的筛选：（1）cDNA序列为完整编码蛋白序列；（2）该cDNA序列长度300 bp；（3）蛋白翻译部位位于细胞质；（4）质粒、转座子及病毒上的基因不予考虑；（5）多拷贝基因不重复计算。 1.3相关密码子偏性分析指标 通过CodonW软件来分析GDF9基因密码子使用偏性，分析数值包括有效密码子数（effective nu
5、mber of codons，ENc）、密码子偏爱指数（condon bias index，CBI）、同义密码子相对使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）；同时通过该软件来分析GDF9基因密码子偏性的影响因素，即GC含量（GC）、密码子第3位的GC含量（GC3s）、芳香族氨基酸比例（aromatic amino acid ratio）、蛋白质亲水性（protein hydrophilicity）的相关性。 1.4碱基替代饱和度检验 利用BioEdit软件对不同哺乳动物GDF9基因的cDNA序列进行比对，将比对结果保存为fasta格式，通过DAMBE软
6、件对比对结果的碱基替代饱和度进行检验，若转换数和颠换数没有达到饱和，可进行下一步的系统发育分析，反之亦然。 1.5系统发育树的构建 通过CodonW软件计算出不同哺乳动物GDF9基因的RSCU值，利用SPSS多元分析软件计算其相应的欧氏平方距离，并进行系统聚类。通过MEGA软件中最小进化法建立系统发育树。 2结果与分析 2.1不同物种GDF9基因序列碱基特征 由表1可知，在12种物种中，灵长目苏门答腊猩猩和人cDNA序列长度最短，但与普通狨猴差别较大，相差250 bp。偶蹄目家牛、牦牛和绵羊cDNA序列最长，但野猪cDNA序列短27 bp，这可能与单胃和反刍动物分类有关。在ATCG碱基分布中，
7、除小家鼠（A+T=45.9%）、野猪（A+T=49.8%）和褐家鼠（A+T=47.2%）外，其余物种A+T碱基含量高于 G+C 碱基含量，表明GDF9基因更倾向于使用A或T碱基。 2.2密码子使用偏性分析 ENc能反映密码子使用频率和同义密码子平均使用频率的偏差。ENc越小，偏好性越强，即高表达基因易于使用一种或几种同义密码子，反之亦然，即低表达基因所包含的稀有密码子种类越多14-15。由表1可知，除家猫之外，其余11种哺乳动物的有效密码子数均小于55，表明GDF9基因对同义密码子使用存在一定的偏好性。但各哺乳动物的GC3s值与其G+C碱基含量有差异。当CBI0时，即在01范围之间；越接近0，
8、表示该基因对密码子使用为完全随机，不存在偏性，反之亦然。本研究所用物种的密码子偏爱指数均0，其中家牛和牦牛的CBI值最小，均为0.024，小家鼠的CBI值最大，为0.107，但该值也远离1，表明不同哺乳动物GDF9基因对密码子的使用不存在绝对的偏好性。 RSCU值的大小能反映同义密码子家族的密码子使用偏移情况，当RSCU=1时，表明密码子使用没有偏性；当 RSCU1 时，表明此密码子使用频率较高16。由表2可知，RSCU1.5的密码子有25个，其中以GCT、TGT、TTT、GGG、ATT、CTG、CCT、CAG、AGA、AGG、ACT、ACC和CTG密?a子的使用频率较高，同时可得出GDF9基
9、因偏好使用A或T结尾的密码子。 2.3密码子使用偏性的影响因素分析 由表3可知，GC、GC3s和Aromo都与CBI呈正相关，其中GC与CBI呈显著正相关，Gravy与CBI呈负相关；GC、GC3s和Gravy都与ENc呈负相关，其中Gravy与ENc呈显著负相关，Aromo与ENc呈正相关。上述结果表明，GC含量和蛋白质亲水性对GDF9基因密码子偏性有影响。 2.4不同物种GDF9基因的碱基替代饱和度检验 图1横坐标代表核苷酸转换数（s）和核苷酸颠换数（v），纵坐标代表基于F84模型建立的遗传距离。GDF9基因的核苷酸转换数和颠换数均随着遗传距离的增加而变大，且两者呈线性增加关系，表明本研究
10、所用的12种哺乳动物GDF9基因序列碱基替代未达到饱和，可进行下一步的聚类分析。 2.5GDF9基因的聚类分析 由图2可知，12种哺乳动物共分为三大类：一类是偶蹄目家牛、牦牛、绵羊、山羊和野猪；一类是灵长目苏门答腊猩猩、人、普通狨猴和食肉目家猫、家犬；另一类是啮齿目小家鼠和褐家鼠，其中灵长目和食肉目的亲缘关系较近，而偶蹄目、灵长目、食肉目与啮齿目的亲缘关系较远，其中类间的最大距离标准化是25。由图3可知，偶蹄目和食肉目亲缘关系较近，二者与灵长目亲缘关系较近，啮齿目与其亲缘关系最远。2种不同方法构建的聚类结果不一致，但结合其密码子偏性指标结果发现，亲缘关系较近的物种，其密码子使用偏好性一致。 3
11、讨论 密码子偏好性的研究对了解物种起源于进化、目的基因的改造、 推测未知基因表达水平及预测目的基因最佳宿主奠定了理论基础17-18，同时为转基因研究中的甲基化能否引起基因表达量下降或基因沉默提供参考19。本研究所选12种哺乳动物GDF9基因的有效密码子数值在49.5753.42区间波动，密码子使用上存在一定的偏好性；在碱基序列组成成分上，9种哺乳动物的AT含量高于GC含量，但密码子第3位的GC含量（GC3s）与GC含量存在差异；12种哺乳动物有25个密码子的同义密码子相对使用度1.5，其中以GCT、TGT、TTT、ATT、CCT、AGA、ACT为主，说明GDF9基因偏好使用A或T结尾的密码子。
12、因此推断碱基组成是造成密码子偏好性的原因之一，这与姜艳等的研究结果20一致。 目前的研究认为，碱基差异（突变）、自然选择、cDNA序列长度和tRNA丰度对密码子偏好性均有影响21。Chen等发现自然选择造成的密码子变化可能提高基因表达效率和多肽折叠动力，但这只发生在特定的基因中，甚至在特定基因的特定位置中22。本研究选取不同哺乳动物相同基因，可忽略蛋白自然选择和tRNA丰度等影响，通过分析密码子使用偏性的影响因素，发现GC含量和蛋白质亲水性是影响GDF9基因密码子偏性的主要因素。已有研究表明，GC含量对同义密码子使用偏好性有重要影响，密码子偏好性越强的基因越趋向于使用以G或C结尾的密码子，且密
13、码子偏好性的变化往往由第3位密码子决定23。因子在不存在自然选择压力的情况下，一定方向的突变压力对第3位碱基种类会有影响24。 本研究基于密码子使用偏性的聚类与基于最小进化法形成的聚类相比，发现同一目下的物种聚为一类，即亲缘关系较近。但2种聚类结果存在差异，主要集中在前者将灵长目和食肉目聚为一类，后者将偶蹄目和食肉目聚为一类。这种聚类结果不一致的现象在植物和其他动物25-28中均出现过，提示我们在今后的研究中，对物种的分离不能仅局限于对碱基组成的分析。可结合密码子使用偏性和编码区序列总和的结果进行分析，这样可为提高分类结果准确度提供重要参考。GDF9基因偏好使用的密码子的确定有利于其转基因表达系统的建立，并对其目的基因的改造和最优密码子的优化等提供理论基础。 4结论 本研究通过分析12种哺乳动物GDF9基因密码子使用模式，发现不同哺乳动物间密码子选择偏性具有差异性，确定该基因的最优密码子为GCT、TGT、TTT、ATT、CCT、AGA、ACT，且偏爱使用A或T结尾的密码子。GC含量和蛋白质亲水性是影响GDF9基因密码子偏性的主要因素。基于密码子使用偏性的聚类与基于最小进化法形成的聚类均表明亲缘关系相近的物种间的密码子使用特征较为一致，但2种方法构建的聚类结果存在差异。