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1、不同方法提取草菇多糖体外抗氧化活性草菇（Volvariella volvacea）菇肉脆嫩，味道鲜美，营养价值高，是食用菌中栽培方法最简单、出菇最快、原料最丰富、最可口的食用菌之一。早在300年前，我国已经进行草菇的人工栽培，后由华侨传到世界各国成为第3大栽培食用菌。我国草菇年产量高于3万t，占全世界总产量的70%80%，居世界之首，故国际上称其为“中国蘑菇”1。 草菇中抗氧化活性成分已有一些报道2-4，主要有总酚类、多糖类、三萜类、黄酮类化合物等。Cheung等采用3种不同方法评价草菇的甲醇提取物和水提取物的抗氧化活性发现，水提取物的抗氧化活性高于甲醇提取物，其抗氧化活性与总酚含量有关3。赵
2、俊霞等用不同有机溶剂对草菇培养液及菌丝体中的代谢成分进行分离提取，代谢提取物均有较高的 DPPH?清除率，即较高的抗氧化活性，其有效成分含有粗三萜、黄酮类物质4。 本研究通过热水提取法、酶法、微波法、碱法4种不同提取方法对草菇多糖进行提取，并测定其体外抗氧化活性，探讨不同提取方法对草菇多糖清除自由基能力的影响，旨在寻找最佳的提取方法，为草菇的精深加工提供理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料 供试材料：草菇子实体，购于农贸市场。 试剂：95%乙醇、氢氧化钠、浓盐酸、维生素C、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）、邻苯三酚、无水乙醇、十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二
3、氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸（trichloroacetic acid，简称TCA）、氯化铁、甲醇、氯化亚铁、乙二胺四乙酸（EDTA），均为国产分析纯；1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美国Sigma公司），菲洛嗪（Ruibio进口分装）。 仪器：赛多利斯电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（金坛市富华仪器有限公司）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；TDL-5A低速台式大容量离心机（湖南星科科学仪器有限公司）；UV-2100紫外-可见分光光度计（北京中教金源科技有限公司）；LGJ-12普通型冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）。 1.2 草菇多糖提取
4、工艺流程 草菇预处理不同方法提取减压浓缩乙醇沉淀透析冷冻干燥草菇多糖。 1.3 草菇多糖提取方法 1.3.1 草菇的预处理 新鲜草菇子实体洗净、去杂、切块，置于105 烘箱灭活10 min；65 烘干、粉碎，得到草菇碎屑；95%乙醇室温过夜，浸提3次，过滤，残渣放置于阴凉处风干待用。 1.3.2 热水提取法 取预处理的草菇干制品，按料液比1 g 20 mL 加入蒸馏水，沸水提取1 h，过滤。按照“1.3.1”节中的步骤共提取2次，合并提取液。 1.3.3 酶法提取法 取预处理的草菇干制品，按料液比1 g 20 mL 加入蒸馏水，纤维素酶、蜗牛酶加入量为0.35%（质量体积比），50 提取90
5、min，升温至90 灭活酶，过滤，得提取液。 1.3.4 微波提取法 取预处理的草菇干制品，按料液比1 g 20 mL 加入蒸馏水，乳化10 min，微波处理功率为490 W，提取8 min，过滤。按照“1.3.1”节中的步骤共提取2次，合并提取液。 1.3.5 碱法提取 取水提后草菇残渣，按照料液比1 g 10 mL 加入0.5 mol/L NaOH溶液，于4 提取2次，每次4 h，过滤，滤液中加入3 mol/L HCl，调pH值至7.0。 1.3.6 提取多糖的浓缩干燥 将提取液于60 减压浓缩至原体积的1/10，4 000 r/min离心10 min，去除沉淀；在浓缩液中缓缓加入95%乙
6、醇，使浓缩液与乙醇体积比为1 4；静置过夜，离心，沉淀物用蒸馏水溶解，溶解液透析（分子截留量为10 ku），冷冻干燥，分别得到水提多糖WPF75、蜗牛酶提多糖SAPF75、纤维素酶提多糖CAPF75、微波提多糖MPF75、碱提多糖APF75。 1.4 草菇多糖的含量测定 多糖的含量测定采用苯酚-硫酸法，参照2005年版中华人民共和国药典。 1.5 抗氧化活性的测定 1.5.1 ? OH清除活性的测定5分别吸取1.0 mL各浓度样液，依次加入3.0 mL 2 mmol/L FeSO4溶液、3.0 mL1 mmol/L H2O2溶液，静置10 min。再加入3 mL 6 moL/L水杨酸溶液，37
7、 水浴30 min，在510 nm处测定吸光度D510 nm，以维生素C作阳性对照。清除率计算公式： 清除率=1-（Di（510 nm）-Dj（510 nm）/D0（510 nm）100%。 式中：Di（510 nm）为不同多糖浓度下的吸收度；Dj（510 nm）为用蒸馏水代替水杨酸时测得的不同多糖浓度本底吸光度；D0（510 nm）为用水代替多糖样品时测得的空白对照吸光度。每个浓度平行测3次，求清除率的平均值。 1.5.2 清除活性测定6取4.5 mL50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液（pH值=8.2），加入1.0 mL各浓度样液，25 水浴20 min，立即加入0.4 mL于25 预热过的25 mmol/L邻苯三酚溶液，25 水浴5 min。加入1 mL 8 mmol/L HCl 终止反应，在320 nm处测定吸光度D320 nm，以维生素C作阳性对照。清除率计算公式：