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1、不同质量浓度Cu2+对草鱼脑、肝胰脏组织结构及肝胰脏中SOD活性的影响鱼类作为人类重要的优质蛋白质来源被广泛食用，但是随着近年来工业的发展，大量的工业废水以及鱼类饲料中所含有的过量Cu2+流入水域中，使鱼类的生存水环境受到了严重污染，同时也影响了鱼类的品质。重金属在食物链中具有富集作用，会随着生物等级的升高而富集，当被人体食用后在人体的各个组织器官中累积，从而引发机体的慢性中毒，危害人体健康，甚至危及生命1。金属铜是水生生物所必需的微量元素，对多种与生长发育相关的生物酶的组成和功能起着重要作用。适量的铜有利于维持水产动物内环境的稳定和机体的平衡，在机体造血、生长繁殖、维持生产性能、提高机体免疫
2、力等方面具有非常重要的作用2。但过量的铜能够引发蛋白质、脂质以及DNA的损伤，特别是在高浓度时，则会引起神经变性的失调3。草鱼（Ctenopharyngodon idellus）作为我国淡水养殖四大家鱼之一，也是主要的池塘养殖品种，养殖范围与面积非常广，草鱼在全国各地的河流、湖泊、水库中皆有分布。每年的草鱼总产量居于所养水产养殖品种的前列，草鱼肉质细嫩、个体大、肌间刺少；含有丰富的不饱和脂防酸，营养价值非常高；另外草鱼的消化力强，生长快，适应能力强，具有极高的经济和研究价值。目前有关草鱼的研究主要集中在营养价值、转基因抗病、人工繁殖、疾病防治等方面，而对于养殖水环境重金属污染对草鱼毒性效应方面
3、的研究较少。 养殖水环境中的Cu2+的毒性主要取决于在生物体内的吸收和积累，所以，研究在一定含量和时间下，Cu2+在草鱼鱼种组织中的吸收、积累的影响，有利于揭示重金属离子的吸收、积累机制。因此，本试验主要研究了养殖水体中不同浓度Cu2+对草鱼脑和肝胰脏组织学及肝胰脏中超氧化物歧化酶活性的影响，为研究重金属的毒性积累和毒性机制提供参考。 1材料与方法 1.1材料 试验用草鱼购自河南省洛阳市水产市场，暂养3 d后进行试验。暂养期间24 h连续充气，每天投喂市售商品s饲料12次，并及时清理残饵及粪便等杂物。正式试验前停食 1 d，选取体长8.010.0 cm、体质量约10 g、体质健壮、规格整齐的个
4、体进行试验。试验在6 L水桶中进行。Cu2+由硫酸铜（CuSO4?5H2O，分析纯，上海化学试剂总厂生产）配制。 1.2方法 试验用水为曝气24 h的自来水，水温为（201） ，pH值为中性（7.00.5），试验期间连续充气。每水桶中加入1 L 药液、10尾草鱼，不投喂也不充氧。死亡标准为腹部朝上、失去游动能力、针刺无反应，死亡个体及时捞出。 1.2.1预试验以10倍之差估计5个浓度，每个浓度用5尾鱼苗，试验处理24 h，分几次进行，分别找出Cu2+的100%致死浓度与最小致死浓度，同时记录不同浓度的各个组草鱼鱼苗的反应。 1.2.2正式试验本试验采用10 cm左右、体质量相近的草鱼苗作为试验
5、对象，随机分为6组，每组3个重复，每组随机分配10尾鱼，放在形状相同的塑料桶内试验4 d。0组为对照组，只采用曝气后的自来水进行饲养；其他1、2、3、4、5组及各重复依次采用的浓度为0.093 75、0.187 50、0.375 00、0750 00、1.500 00 mg/L，溶液的体积均为1 L。试验过程中，记录好试验开始的时间，随时观察桶内鱼苗的生活状况，并记录24、48、72、96 h各个试验组死亡鱼苗数，算出平均死亡率，用直线内插法求出半数致死量。安全浓度（SC）计算公式：SC=（48 h LC500.3）/（24 h LC50/48 h LC50）2；SC=96 h LC500.1
6、。 及时捞出各浓度下死亡的草鱼以及对照组的草鱼，取出肝胰脏和脑组织，将一部分组织放入10%甲醛溶液中固定，用来制作组织切片；另一部分肝脏装入1.5 mL EP管中并做好明确标记，置于-20 冰箱中保存，最后采用试剂盒（南京建成生物工程研究所）的方法测定肝胰脏组织中超氧化物歧化酶（SOD）的活性。 1.3数据的统计与分析 试验测得的所有数据均采用Excel进行整理；运用SPSS软件中的One-Way ANOVA检验进行统计分析。 2结果与分析 2.1草鱼Cu2+中毒的行为症状 草鱼在试验开始立即变得兴奋，3 h后开始出现不良症状，约9 h后出现死鱼。高浓度试验组鱼苗兴奋性比低浓度组高，1 h后高
7、浓度组试验鱼游动加快上下窜动，常浮出水面试图跳出塑料桶，此时试验药液浑浊。低浓度组鱼苗也出现相同症状，但约6 h后低浓度组逐渐恢复平静，试验药液逐渐澄清，而高质量浓度组仍有试验鱼试图跳出塑料桶，7 h后各质量浓度组鱼苗恢复平静，体表分泌1层白色絮状黏液，游动减慢，反应较迟钝。随后高质量浓度组有鱼出现身体失去平衡，有侧游翻转等现象，中毒鱼不时挣扎直至死亡。死亡时，胸鳍展开口、鳃盖张开，呈现呼吸困难状态。将中毒后的死鱼进行解剖，与对照组活鱼比较，中毒鱼体表黏液分泌增多，鳃丝肿胀，肝肿大、色泽变暗，胆囊肿大、胆汁充盈，肾脏充血，色泽变暗。鱼苗的体表常伴有溃烂的斑点，死亡后鱼体发白。 2.2Cu2+对
8、草鱼的急性毒性 由表1可见，Cu2+浓度与草鱼的平均死亡率之间呈现明?的时间效应和剂量效应关系，即相同的时间内，草鱼的死亡率随着Cu2+浓度升高而增加；相同浓度下，草鱼的平均死亡率随着时间的延长而增加。 不同暴露时间下，Cu2+浓度与草鱼死亡率的线性回归方程及相应时间下的半致死浓度（LC50）、安全浓度的计算结果如表2所示。由表2可见，Cu2+ 24 h的半数致死量为 1.278 mg/L，48 h的半数致死量为1.227 mg/L，72 h的半数致死量为0.276 mg/L，96 h的半数致死量为0.119 mg/L，用公式算得的安全浓度为0.361 mg/L，用公式算得的安全浓度为0.01
9、1 9 mg/L。 2.3Cu2+对草鱼肝胰脏和脑组织结构的影响 组织切片观察发现，Cu2+处理的草鱼脑细胞出现不同程度的异常（图1）。图1表明，对照组草鱼肝胰脏细胞完整，可以清晰地分辨细胞轮廓，无异常；Cu2+处理24 h时，肝脏细胞结构多不完整，轻微异常，细胞轻微膨大，呈离散状态，细胞核相对缩小，胞浆轻微溢出；Cu2+处理96 h时，肝胰脏细胞明显膨大，无序散程度增大，细胞核明显相对缩小，少数肝细胞胞浆完全溢出，残留的核物质散乱分布，肝细胞出现凝固性坏死，正常壁状结构消失。 图2表明，对照组草鱼脑细胞完整，可以清晰地分辨出细胞轮廓，无异常；Cu2+处理24 h时，脑组织轻微异常，脑细胞轻微
10、聚集，细胞核轻微增大；Cu2+处理96 h时，脑组织异常严重，脑细胞聚集明显，细胞核明显增大，几乎充满整个脑细胞。Cu2+诱导自由基介导过程发生改变，脂质过氧化，生物膜被破坏和细胞功能障碍，以上组织病变程度随着处理时间的延长而加深。 2.4不同浓度Cu2+对草鱼肝脏SOD的影响 由图3可知，与对照组相比，24 h时，Cu2+浓度 0.187 5 mg/L 处理组草鱼肝胰脏SOD活性下降不显著，到96 h时下降显著；1.5 mg/L时，24、96 h时草鱼肝脏SOD活性下降显著（P48 h LC5096 h LC50。这与周辉明等报道7相一致。 3.2Cu2+对草鱼脑和肝胰脏组织结构的影响 本试
11、验结果表明，随着Cu2+暴露时间的延长，草鱼脑组织的形态变化和损坏程度加深：脑细胞轻微聚集，细胞核微增大，几乎充满整个脑细胞。本试验研究发现，草鱼在Cu2+中毒后有过度兴奋的现象，特别是在中毒后期，且在游泳时会出现横冲直撞的现象，身体明显不平衡。这与刘伟等研究Cu2+对锦鲤（Cyprinus carpio haematopterus）的急性毒性时锦鲤的中毒现象8很相似。这可能与重金属对脑的影响主要表现在鱼体的神经性反应方面有关，但具体原因还有待于深入研究。 肝胰脏是鱼类重要的解毒器官，同时也是蓄积重金属的主要部位，本试验中Cu2+中毒而死的鱼的肝胰脏损伤主要表现为组织细胞高度分散，出现细胞体积
12、增大，细胞核增大，核仁核膜明显，细胞核被挤向细胞边缘偏离细胞中心，且出现大面积肝细胞解体坏死等现象，肝组织出现局部灶性坏死等病变现象。这与常藕琴等研究Cu2+对剑尾鱼（Xiphophorus hellerii）9、王利等研究Cu2+对鲤鱼（C. carpio）10以及徐永江研究的Cu2+对半滑舌鳎鳃（Cynoglossus semilaevis Gunther）的急性中毒肝胰脏病变症状11基本一致。且徐永江在Cu2+对半滑舌鳎鳃研究中发现，重金属对胚胎发育的毒性由大到小依次为CuHgCdZnPb11，可见Cu2+对水生动物的毒性还是很强的。 3.3Cu2+对SOD活性的影响 SOD作为保护酶系
13、统，能维持体内活性氧的产生和清除的动态平衡，防止自由基的毒害，是机体防御过氧化损害系统的关键酶之一。徐立红等认为，在生理状态下，当某些污染物在体内进行生物转化时会产生氧化还原循环生成大量活性氧，如 O-2? 、?OH、H2O2等，这些活性氧又可使DNA断裂、脂质过氧化、酶蛋白失活等，从而引起机体氧化应激反应，在这些活性氧产生及转化中SOD等起着非常重要的作用12。唐学玺等研究表明，当生物体受到重度逆境胁迫时，SOD活性通常会降低，使生物体内积累过量的活性氧，从而导致生物体的伤害13。本试验结果发现，随着浓度升高和试验时间延长，Cu2+对肝脏SOD活性的抑制越来越明显。在高浓度Cu2+胁迫下，草鱼肝胰组织内的SOD活性极显著下降，因此，Cu2+胁迫下SOD活性的降低、过量的活性氧很可能是Cu2+对草鱼形成毒害的重要原因之一。由于草鱼肝胰脏组织SOD活性的降低程度与水体Cu2+污染水平有一定的关系，这一现象可否用Cu2+作为检测水体污染的一种生物学指标，还有待进一步深入研究。