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1、肿瘤干细胞 肿瘤组织及肿瘤细胞系中有一部分的肿瘤 细胞充当干细胞的角色，在启动肿瘤形成 和维持肿瘤生长中起决定性作用。 特点：自我更新，高致瘤性，多向分化 肿瘤干细胞来源于组织正常干细胞的突变 或进一步分化的短暂增生的祖细胞的突变 Tumor cell 肿瘤干细胞是肿瘤发生发展的重要细胞，目前的治 疗方法可以杀死分化的肿瘤细胞，但对于肿瘤干细 胞却无效，造成肿瘤的复发和转移。 the drug- resistant cells 溶瘤腺病毒 溶瘤治疗原理:通过对自然界存在的一些致 病力较弱的病毒进行基因改造制成特殊的 溶瘤病毒利用靶细胞中抑癌基因的失活 或缺陷从而选择性地感染肿瘤细胞，在其 内大
2、量复制并最终摧毁肿瘤细胞。 Ramon Alemany。Cancer selective adenovirusesJ.Molecular Aspects of Medicine, 2007,28(1):42-58. 由于目前没有有效的针对肿瘤干细胞的靶 向治疗，所以我们利用溶瘤腺病毒能选择性地 感染肿瘤细胞，在其内大量复制并最终摧毁肿 瘤细胞的特性，研究其对乳腺癌干细胞的作用 ，找寻根除乳腺癌干细胞的方法。 单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 *7 MCF-7 细胞 病毒转染 CD44，CD24流式细胞分析 微球体培养 技术术路线图线图 ： 对照组 CD44，CD24流式细胞
3、分析 微球体形态、大小、MFE的 测定 Wnt Hotch HH CXCR4等通 路 正在进行中 CD44+CD24-细胞 CD44+CD24-细 胞 方法 病毒构建 病毒感染 微球体培养 CD44+CD24-细胞表型流式(FCM)分析 Ramon Alemany。Cancer selective adenovirusesJ.Molecular Aspects of Medicine, 2007,28(1):42-58. 微球体培养 在无血清的含bFGF、EGF的培养液下培养， 形成细胞微球体。这种微球体富含CD44 CD24-/low细胞，不表达分化腔上皮、肌上 皮等分化标志物，在分化条件下
4、培养具有 多系分化的能力，致瘤性也明显提高，通 过微球体培养成功的分离出了乳腺癌干细 胞，并成为乳腺癌干细胞体外培养的一种 方法乳腺癌干细胞的富集方法。 Ponti D, Costa A, Zaffaroni N, et al.Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell propertiesJ. Cancer Res,2005, 65(13):5506-5511. Phillips TM, McBride WH, Pajonk F. The res
5、ponse of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiationJ. J Natl Cancer Inst, 2006, 98(24):1777-1785. 微球体培养方法 储存液：2 终浓度 EGF（表皮生长因子） 40ng/ml b-FGF (碱性成纤维细胞生长因子) 20ng/ml B27 0.8 胰岛素 10ug/ml 工作液既1，用时对半稀释，但不要加 血清维持PH值：7.27.4。 结果 病毒对乳腺癌细胞效应 病毒感染MCF-7细胞第5天，显微镜下观察 见大约30%细胞折光率好，细胞保持原有形 态；而70%
6、细胞萎缩，无折光率，呈悬浮状 态,表示死亡。 对照组细胞培养第5天，细胞生长良好。 E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒具有较强的杀 伤MCF-7细胞作用 病毒对乳腺癌干细胞溶瘤效应 MCF-7细胞加入病毒5天后 CD24+细胞的比例： 56.10% MCF-7细胞培养5天后 CD24+细胞的比例： 93.26% MCF-7细胞加入病毒5天后 CD44+细胞的比例： 63.26% MCF-7细胞培养5天后 CD44+细胞的比例： 88.30% 用E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒感染MCF-7细胞 后，与正常MCF-7细胞相比，CD44+CD24-细 胞比例增大。 MCF-7细胞加入病毒5天后 CD44+CD2
7、4-细胞的比例： 22.19% MCF-7细胞培养5天后 CD44+CD24-细胞的比例： 2.30% 病毒对乳腺癌干细胞微球体影响 定义60um的球体为微球体 第4天时，才有微球体形成 感染病毒的MCF-7细胞微球体培养 40 210195um MCF-7细胞微球体培养 40 155150um d2 d4 d5 d7 d10 mammosphere-forming efficiency,MFE MCF-7细胞微球体培养13天 后球体计数及MFE 微球体数=1800 MFE= 0.9% 加入病毒五天后的MCF-7细胞 微球体培养13天后球体计数及 MFE 微球体数=2520 MFE= 1.26
8、% E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒感染MCF -7后进行微球体培养，成球时间早 于对照组，且球体体积比对照组大 。MFE大于对照组。 对微球体中CD44+CD24-细胞的 影响？ 微球体培养后，两组 细胞CD24+的比例 红色：加入病毒组的 CD24+比例： 37.28% 蓝色：对照组（MCF- 7细胞）CD24+比例 ：72.1% E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒感染MCF-7细胞微球体 CD44+CD24-干细胞表型的细胞的比例高于对照细 胞. MCF-7细胞微球体培养13天后 CD44+CD24-细胞比例：23.35% 加入病毒五天后的MCF-7细胞 微球体培养13天后 CD44+CD24-细胞比
9、例 38.08% 结论 E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒具有较强的杀伤 MCF-7细胞作用。 E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒感染MCF-7细胞 第5天有30%细胞存活，并且CD44+CD24- 干 细胞表型的细胞比例是对照细胞的9.65倍 ，微球体形成数量和MFE值亦明显高于对照 细胞，表明 E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒杀 伤MCF-7细胞作用主要是杀伤乳腺癌分化细 胞，而对乳腺癌干细胞没杀伤作用。 E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒感染MCF-7细 胞微球体CD44+CD24-干细胞表型的细胞 的比例高于对照细胞1.6倍,成球时间早于 对照细胞，且微球体体积比对照细胞大， 提示E1B蛋白缺陷型溶瘤腺病毒可能对乳
10、 腺癌干细胞有促进作用，加快其自我更新 和分化速率。 展望 我们将进一步深入研究E1B蛋白缺陷型溶瘤 腺病毒在乳腺癌干细胞的信号转导通路（ Wnt Hotch HH CXCR4）上的作用，并进行 体内成瘤试验。 以本研究为基础，构建新型肿瘤干细胞特 异靶向的溶瘤病毒。 本研究为以肿瘤干细胞为靶点的有效的溶 瘤病毒、基因药物或化学药物筛选提供了 重要方法。 单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 *27 致谢 导师张凤导师张凤 春教授 （上海仁济医院肿瘤科主任） 徐迎春博士（上海仁济医院肿瘤科医生） 张张雁云教授（中国科学院上海生命科学院健康科学 中心免疫学联合实验室） 黄明主，林叔成师兄； 肿瘤科的全体医护人员，研究生 谢谢谢谢