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1、HIV颗粒,艾滋病：Acquired Immunodeficiency Syndroms，AIDS 获得性免疫缺陷综合征,人免疫缺陷病毒 Human Immunodeficiency Virus HIV,HIV的生命周期及药物作用靶位,RNA,DNA,HIV,Nucleus,宿主细胞,核苷类逆转录酶抑制剂 (NRTIs),非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs),蛋白酶抑制剂 (PIs),逆转录酶,0,抗HIV药物研发和应用取得长足进展 共6类34种药物 6种固定剂量药物合剂 2种进入/融合抑制剂 1种整合酶抑制剂 5种非核苷类逆转录酶抑制剂 11种核苷（酸）类逆转录酶抑制剂 9种蛋白酶抑制剂,H
2、IV的耐药性 由于HIV的基因发生突变，导致病毒对药物的敏感性下降 是抗病毒治疗失败的主要原因,耐药性产生的原因,病毒自身因素 内因 药物的选择压力 外因,高复制速率,重组,高突变率,1 substitution per genome per round,7-30 crossovers per genome per round,10.3x109 virions per day,HIV-1:人类最大遗传变异的病原体,体内的HIV是彼此不同的一群病毒,全基因组中只有很少的核苷酸是保守的，是复杂的病毒群体（准种 Quasispecies）,耐药性产生：药物选择压力 外因,在药物选择压力下，耐药变异株
3、完全取代药物敏感株最快发生在14 至28天内,耐药株是在病毒自发性的、高频率的基因突变中产生，在药物选择性的压力下优势复制的结果。,HIV-1耐药突变,病毒对抗逆转录病毒药物产生抗性 病毒酶和底物的结合能力下降(PI, NRTI, NNTI, EI) 磷酸化水平增加 - ATP或焦磷酸盐可以介导切除链末端终止子的反应，从而破除链终止作用，并且可以补偿性增强聚合酶的活性 降低病毒复制能力 增加病毒对其他抗逆转录病毒药物的敏感性 改变抗原表位 编码缺陷病毒,耐药是怎样发生的？,0,敏感 毒株,耐药 毒株,药物抑制了敏感 毒株的复制,耐药株成为 优势毒株,药物,药物压力,时间,病毒的动态和耐药性,病
4、毒载量 和复制速率,耐药是怎样发展的？,0,野生毒株 占优势,耐药毒株 出现的早期,耐药毒株 占优势,野生毒株,耐药毒株,获得耐药病毒的两种途径 - 直接获得: 被耐药病毒感染 - 药物选择: 病毒复制过程中可产生随机突变，由于药物压力不 足，导致耐药性突变累积,ART,Off Rx,传播,No ART,耐药性毒株的出现和传播,?,原发耐药：从未治疗过的病人的耐药 继发耐药：治疗后出现的耐药,原发感染后耐药毒株能持续吗？,0,野生型 毒株,耐药性 毒株,原发感染毒株,6个月后分离的毒株,24个月后分离的毒株,有些耐药毒株可以持续！,0,野生型 毒株,耐药性 毒株,原发感染毒株,6个月后分离的毒
5、株,24个月后分离的毒株,HIV-1耐药病毒的传播,发生率缓慢增加; 5-25% 抗逆转录病毒治疗(ART)效果降低 耐药毒株的传播是病毒的复制适应性和获得耐药毒株的概率二个因素的函数 病毒的复制适应性、病毒抑制的程度以及接受治疗病人危险行为的类型是影响耐药毒株传播的重要因素。,复制适应性影响耐药毒株的传播,在博茨瓦纳，数学模型研究的结果 即使获得耐药毒株的概率很高，但如果耐药毒株的复制适应性是野生毒株的一半，到2009年，耐药HIV毒株的流行率也达不到WHO提出的15%的警戒线水平 如果耐药毒株的复制适应性与野生毒株相同，到2009年，耐药HIV毒株的传播率将超过警戒限水平,很多停止抗病毒治
6、疗的病人，由于没有了药物压力，野生毒株取代耐药毒株获得生长优势，这往往伴随着CD4细胞数的下降 而抗病毒治疗失败产生耐药的很多病人，尽管病毒未受到有效抑制，但CD4细胞数仍高于治疗前的水平 可能耐药毒株的毒力和致病性比野生型病毒低，即使产生了耐药，维持耐药毒株占优势对病人可能也有好处,耐药毒株的复制能力与致病特征？,耐药毒株的流行率,% of resistant isolates,San Francisco 总医院新感染病人中耐药毒株的流行率,0,我国部分地区抗病毒治疗失败病人的耐药谱,病毒-宿主-药物因素对HIV-1耐药毒株产生的影响,宿主: 服药依从性 基因多态性：酶的等位基因 CD4 &
7、 辅助受体的水平,促使耐药性病毒株出现的因素,服药依从性与耐药性病毒株,病毒学失败率 (%),0,20,40,60,80,100,95,90-95,80-90,70-80,70,服药依从性 (%),82.1,71.4,66.7,54.6,21.7,依从性与耐药的关系,0,药物配伍不当 药代显著不同药物配伍,与HIV-1耐药病毒相关的临床因素,耐药病毒的原发感染 药物的遗传屏障不充分 在低浓度药物作用时病毒进行复制: 药物剂量不足 服药依从性 介于 “好” 和“中度”之间 宿主遗传多态性 (MDR-1, etc) 间断治疗 (STI),耐药性突变的表示方法 野毒株的氨基酸氨基酸的位置突变后的氨基
8、酸 K103N 一级突变（Primary Mutation）：自身就可导致病毒对药物的敏感性降低 二级突变（Secondary Mutation ）：与一级突变结合导致病毒对药物的敏感性降低或提高了一级突变毒株的复制适应性,主要耐药性突变举例,I54/V/T/L/M 对蛋白酶抑制剂的高度耐药性 M46I/L 对蛋白酶抑制剂的高度耐药性 M184V/I 对Lamivudine的高度耐药性 Q151M 对NRTI的中度耐药性 K103N/R 对NNRTI的高度耐药性 V106V/M 对NNRTI的高度耐药性 G190A 对NVP的高度耐药性,L N R,W YF,Q,41,67,70,560,AZ
9、T,L T,(Wild Type),1 (Mutant),219,215,210,K,M,D,K,L,M,K,ddC,T,D,65,74,184,69,41,67,70,219,215,210,d4T,75,V,TMSA,Mutation,Selected in vitro,ABC,74,115,Y,F,V,219,184,215,210,41,67,70,65,3TC,184,E,118,V,I,44,D,VI,Clinical significance under investigation,NRTIs 导致的逆转录酶基因突变,0,核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）,TAMs突变( Thy
10、midine analogue-associated mutations) TAMs-1: M41L、L210W、T215Y、D67N等 TAMs-2: D67N、K70R、T215F和K219Q Q151M突变复合体: A62V、S68G、V75I、F77L、F116Y和Q151M等 特点，一是首先大量出现非典型突变，而后逐渐发展为典型耐药突变。 二是多个突变的积累才能导致高度耐药性。,SA,L K,100,181,100,NVP,DLV,EFV,V,V,103,106 108,188,190,Y,G,I N A I,C LH A,L,103,103,108,181,Y,CI,236,P,C
11、,188,L,190,225,P,H,560,1,NNRTIs 导致的逆转录酶基因突变,0,非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs）,NVP、DLV和EFV 最常见的突变是Y191C、K103N和G190A等 特点: 一是发生早 二是遗传屏障低，单一突变就可以导致高度耐药性，并可对同类药物产生广泛的交叉耐药性 三是突变很稳定，即使停药以后，血药浓度降低，突变也能够在血液中稳定地存在。,K,V,L,1,99,10,L,IDV,20,24,32,L,L,M,46,I,54,71,I,V,G,A,82,84,90,54,71,82,84,90,10,48,54,71,82,84,90,71,77,82
12、,88,90,VL,IL,F,G,V,D,36,30,46,N,84,I,46,I,10,RTV,SQV,NFV,APV,46,32,FIRV,54,47,50,I V,10,FI,IL,84,AFTS,77,73,S,A,77,36,73,77,M,V,M,V,AFTS,I,V,SA,VT,I,I,I,I,IRV,MR,20,32,33,36,N,D,V,VM,84,46,10,LPV/RTV,54,53,20,24,71,82,90,63,L,P,F,L,10,PIs 导致的蛋白酶基因突变,0,膜蛋白gp41基因区突变与膜融合 抑制剂的抗性相关,HIV耐药性毒株的检测方法,HIV耐药性检测
13、方法 基因型耐药性检测：检测HIV基因组中与耐药性相关的基因突变 表型耐药性检测：检测病毒在药物存在的情况下复制和生长的能力，是药敏试验,基因型耐药检测,获得编码HIV逆转录酶和蛋白酶的基因序列 检测和报告这些基因序列中耐药相关的基因突变,AAA GAC AGT,AAA AAC AGC,Lys,Asp,Ser,Lys,Asn,Ser,Codon,Mutation,0,基因型耐药性检测,针对特定基因突变,针对病毒基因序列,杂交法：LiPA等,测序法：TruGene 等,HIV-1基因型检测方法,对病毒pol或gag-pol基因进行测序 - 检测与体内或体外耐药相关的突变 双脱氧链末端终止法 试剂
14、盒 (ABS, VGI) 或 实验室自建方法“in house” 寡聚核苷酸点阵杂交(Affymetrix) 不能及时检测“新”的突变 检测点突变 线性探针检测法 (LiPA) 引物特异性的PCR 寡核苷酸连接法 (OLA) 连接扩增法 (LigAmp),HIV基因型耐药性检测 （序列测定法 in House）,耐药检测的实验室工作步骤,分析前标本处理,采集标本,标本编号,提取核酸,核酸扩增,序列装配,序列编辑,耐药确定,数据编辑,序列测定和 质量评价,标本 新鲜EDTA抗凝血浆，或-80保存，避免反复冻融,直接测序法的检测流程,病人血浆标本,HIV RNA,病毒 cDNA,HIV RT和PR
15、基因片段,序列测定,结果解释,RNA提取,逆转录,PCR扩增,特定的解释系统,病毒RNA提取（ Qiagen公司试剂盒）,裂解标本，灭活RNA酶,加到离心柱中，RNA与硅胶膜结合,洗两次，去除杂质,用无RNA酶的缓冲液洗脱RNA,收集RNA备用,优点：操作简便、快速、得率高,逆转录 RNA cDNA,反应体系： 10XBuffer 1l dNTP 0.5l 外侧反向引物 1l RNase inhibitor 0.25l M-MuLV RT 0.25l DEPC水 2l RNA模板 5l 42水浴1小时，95 5分钟灭活RT,逆转录 RNA cDNA,反应体系： 10XBuffer 1l dNT
16、P 0.5l 外侧反向引物 1l RNase inhibitor 0.25l M-MuLV RT 0.25l DEPC水 2l RNA模板 5l 42水浴1小时，95 5分钟灭活RT,巢式PCR扩增病毒蛋白酶和逆转录酶基因,第一轮扩增反应体系： 10XBuffer 5l MgCl2 3l dNTP 1l 外侧正向引物 1l 外侧反向引物 1l Taq酶 0.5l 水 29.5l cDNA模板 10l 945min，9430sec，5530sec，722.5min 30循环,巢式PCR扩增病毒蛋白酶和逆转录酶基因,第二轮扩增反应体系： 10XBuffer 5l MgCl2 3l dNTP 1l
17、内侧正向引物 1l 内侧反向引物 1l Taq酶 0.5l 水 29.5l 第一轮扩增产物 10l 945min，9430sec，5530sec，722.5min 30循环,扩增产物鉴定：琼脂糖凝胶电泳,扩增产物纯化 QIAquick Gel extraction试剂盒 核酸序列测定 双脱氧链末端终止法,: Protease: CCTCAAATCACTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAGTAAAGATAGGGGGGCAATTAAAGGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATGAATTTGCCAGGAAAATGGAAACCAAAA
18、ATGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAAAGTAAGACAGTATGATCAGGTATCCATAGAAATCTGTGGACATAAGGCTGTAGGTACAGTATTAATAGGACCTACACCAGTCAACATAATTGGGAGAAATCTGTTGACTCAGATTGGTTGCACTTT RT: AAATTTTCCCATTAGTCCTATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAATGGGAAAGGAAG
19、GAAAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAGTATTTGCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTCAATAAAAGAACTCAAGACTTTTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCACATCCCGCAGGATTAAAACAGAAAAAATCTGTAACAGTCCTGGATGTGGGTGATGCATATTTCTCAGTCCCTTTAGATAAAGACTTCAGGAAGTACACTGCATTTACCATACCTAGTGTAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATATC
20、AGTACAATGTACTTCCACAGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCCAATGTAGTATGACAAAGATCTTAGAGCCTTTTAGGAAACAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGATGATTTGTTAGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAGCAAAAATAGAGGAACTGAGACAACATCTGTTGAGGTGGGGATTTACCACACCAGACAAAAAACATCAGAGAGGACCTTCCATA,0,斯坦福大学HIV耐药数据库http:/hivdb.stanford.edu,基因型耐药性的结果表示
21、形式,耐药性突变 耐药性突变计分 耐药性解释,来自序列比对的结果 http:/hivdb.stanford.edu,高度耐药(H)：大于60分 中度耐药(M)：3059分 低度耐药(L)：1529分 潜在低度耐药(PL)：1014分 敏感(S)：09分,耐药性突变计分及耐药性解释,基因型耐药性检测的特点 优点：简便快速、经济 缺点：间接定性测定耐药性 解释结果往往困难 没有临床临界值（Cut-off） 不能立刻检测对新药的耐药性 条件：病毒载量500-1000cp/ml 突变株占病毒准种的20以上,基因型耐药性检测的局限性,多轮PCR扩增,检测结果只出现一种基因型；优势主要的变异病毒,患者体内
22、有上亿拷贝的病毒，其中的一部分被扩增,基因型耐药检测结果的解释,基因型耐药检测报告应包括特定突变临床意义的解释 但是: 很多突变准确的临床意义仍不清楚 突变之间的相互作用使得临床意义的估计更加复杂 基因型耐药检测结果还没有标准的解释 不能检测劣势毒株 (10-20% ),0,表型耐药性检测 优点：直接定量测定耐药性 结果容易解释 有临床临界值（Cut-off） 可立即检测对新药的耐药性 缺点：操作复杂、价格昂贵、耗时长,传统的表型耐药性检测方法,分离培养HIV,HIV感染性滴度测定,定量HIV感染PBMC细胞，培养 培养液含系列稀释的待测药物,HIV药物敏感毒株,测定培养上清液的P24抗原,与
23、野毒株比较并计算IC50，,表型耐药性检测,分离病毒,在药物存在的情况下培养,计算IC50,传统 方法,克隆病毒RT、PR基因,插入含报告基因的骨架病毒,转染细胞,在药物存在的情况下培养,计算IC50,改良 方法,表型耐药检测,检测病毒在药物存在下的复制能力 与传统的细菌药敏试验相似 结果报告为对药物敏感性倍数的变化,0,+,患者体内病毒基因片段t,报告基因,PR,RT,IN,荧光素酶,A-MLV env DNA,耐药表型测试 载体DNA,耐药表型测试 载体DNA,重组病毒法进行 表型检测(ViroLogic PhenoSense) 价格Costs $1000/标本 检测的重组病毒由患者的po
24、l基因，带有报告基因（荧光素酶）并且env基因缺陷的HIV标准病毒构建 重组病毒与双嗜性的鼠白血病病毒（MLV）共转染 检测假病毒颗粒对不同稀释度药物的敏感性 携带患者pol基因重组病毒IC50 或IC95值 与标准病毒进行比较,表型耐药性检测方法,IC50 = 50% 抑制浓度,结果表达方式:病毒的50%抑制浓度(IC50)及其与野毒株相比增加的倍数,IC50增加的倍数是耐药程度的度量,药物,IC50增加倍数,ZAT 4.0 3TC 48.1 NVP 1.4 DDI 1.4 IDV 3.0,表型耐药性,通常用病毒与实验室标准株比较的IC50或IC90值增加倍数表示， 结果解释 检测值的界定
25、- 如2-10倍=中度耐药；10倍=高度耐药） 生物学 - 超过未治疗患者体内分离病毒药物抑制浓度的范围 临床 - 倍数与临床研究中的病毒复制抑制失败相关,3TC耐药株诱导及基因型和表型耐药性检测,PhenoSense HIV Report,0,虚拟表型（Virtual Phenotype）,基因型,Protease,RT,HIV,数据库,Genotype & Phenotype Data,虚拟表型,Wild-type HIV,Resistant HIV,0,普遍性抗病毒治疗,2012年7月美国健康和人类服务部更新了成人AIDS抗病毒治疗指南，推荐不论CD4细胞计数多少，所有HIV/AIDS患
26、者都应进行治疗，将治疗作为预防的手段之一。 2012年7月16日，美国FDA批准Truvada（emtricitabine/tenofovir合剂）用于高危人群HIV暴露前的预防 2012年7月22日27日在美国召开的第19届世界艾滋病大会提出了终止AIDS流行的远景,毋庸置疑，抗病毒药物的研发和应用在防治AIDS中取得了显著的成效。但同时，与抗生素在人和动物中广泛使用或滥用导致耐药细菌的类型和数量快速增加一样，抗病毒药物的快速推广应用，导致耐药HIV毒株的出现和传播，不仅影响着抗病毒治疗的效果，导致治疗失败，增加艾滋病相关的死亡，还可能快速消耗有限的药物资源，不利于AIDS防治的长期可持续发
27、展。抗病毒药物还作为一种人为施加的广泛存在的选择压力，深刻影响着病毒的整体变异和进化,由于HIV及其准种的高度变异性、药物种类及其作用机制的多样性，以及基因型和表型检测方法的复杂性，目前，将HIV耐药检测结果整合入临床常规治疗的管理还存在很大问题，耐药检测还未能象其他临床检验一样与治疗有机地结合在一起，制订合理的临床应用指南是耐药检测面临的最大挑战,2012年，美国成人AIDS抗病毒治疗指南 耐药检测方法的选择,目前尚无确定的研究支持哪种耐药检测方法更佳 多数情况下推荐使用基因型检测，因其相对操作简便、省时、花费少，在野生毒株与耐药毒株混合存在的情况下具有较高的敏感性 如果怀疑有整合酶抑制剂及
28、进入/融合抑制剂的耐药HIV毒株，应将扩增测序的区域扩展至病毒的整合酶区和膜区 对有复杂治疗史、怀疑存在复杂耐药突变型的患者，可考虑做表型耐药检测,2012年，美国成人AIDS抗病毒治疗指南 耐药检测对象,所有进入医学观察的HIV感染者和AIDS患者，不论是否进行抗病毒治疗，都应进行基因型耐药检测,2012年，美国成人AIDS抗病毒治疗指南 初始抗病毒治疗患者,应进行耐药检测，以指导并制定抗病毒治疗方案 耐药毒株能够传播并与初始抗病毒治疗的病毒学应答不理想有关 从未经历过治疗的患者也可能携带耐药毒株 对这类患者进行耐药检测有助于选择能够取得最大病毒抑制效果的治疗,2012年，美国成人AIDS抗
29、病毒治疗指南 接受抗病毒治疗的患者,在改变抗病毒治疗方案时、病毒学失败时（HIV RNA1000 copies/ml）及病毒抑制不理想时都应进行耐药检测，以判断是否发生耐药以及对哪种药物耐药，从而指导选择有活性的抗HIV药物后续治疗 研究发现 ，在耐药检测结果指导下制订的抗病毒治疗方案与只根据临床判断制订的治疗方案相比，前者病毒学应答的提高和改善更为显著 对于HIV RNA为5001000 copies/ml的患者，检测的难度比较大，但仍应尽量做；对500 copies/ml的患者则不建议做,2012年，美国成人AIDS抗病毒治疗指南 急性HIV感染者,应进行基线耐药检测，以指导选择能够取得最
30、理想的病毒学应答效果的方案，且首选基因型方法 如治疗，不必等待耐药检测结果出来后再服药，拿到检测结果后，如治疗方案不合适再进行调整 如不治疗，仍推荐进行耐药检测，以确定是否为耐药HIV毒株的原发感染 在不治疗的情况下，耐药毒株可能随着时间减少至检测限下，一旦开始治疗将增加治疗失败的风险。因此，急性期不治疗也应进行耐药检测并记录结果，为以后的治疗提供重要参考,2012年，美国成人AIDS抗病毒治疗指南 慢性HIV感染者,是否应进行耐药检测，目前意见不一致。因尚不清楚传播获得的耐药毒株回复成为野生毒株可能性有多大 传播的耐药突变一般比药物选择出的突变更为稳定，有研究报道在慢性感染者中检测到几年以前
31、传播获得的耐药HIV毒株 已有数据显示基线的耐药突变与治疗应答的不理想相关 推荐对慢性感染者进入临床观察时进行耐药检测,2012年，美国成人AIDS抗病毒治疗指南 孕妇,开始抗病毒治疗前都应做基因型耐药检测 抗病毒治疗的目的是最大程度降低血浆病毒载量并预防HIV母婴传播，首要目的是取得最大程度的病毒抑制 孕妇开始抗病毒治疗前都应进行基因型耐药检测，对已接受治疗而HIV RNA仍能够检出的孕妇也应进行检测,HIV-1耐药性检测的时机选择 抗病毒治疗失败需要进行耐药性检测时，应该在病人仍在服药时或停药后立即（4周内）进行检测 不推荐对病毒载量1000cp/ml的病人做病毒载量检测，因为病毒水平太低
32、很难扩增出目的基因片段,依据耐药结果决定抗逆转录病毒治疗的策略,药物效价以及其他药物因素 服药依从性和其他患者因素 考虑病毒因素和免疫状态 考虑患者体内病毒的总体耐药情况,考虑患者体内病毒的总体耐药情况 基于测序结果制定治疗方案 预留一类或以上的药物为以后的治疗作准备,将初始方案治疗失败的 风险降到最低,将后续方案治疗成功的 机率增加到最大,HIV-1的耐药性不是全或无的现象，基因型和表型耐药性检测结果解释的困难,需要将体外和体内的资料结合起来分析： 所有抗病毒治疗都是联合用药，他们之间是相互协同的，即对一种药物的敏感性降低并不干扰同一治疗方案中其他药物的抗病毒活性 药物即使有耐药性也可能有益
33、处，因为有耐药性突变的病毒比敏感毒株的复制适应性要差得多 血清中药物的水平，特别是蛋白酶类药物是高度变化的，如果能够提高血清中蛋白酶类药物的浓度，低水平的蛋白酶耐药性有时能够被克服,抗病毒治疗失败的原因很多，包括药物的抗病毒活性不足、服药依从性差及个体药物代谢动力学差异等，耐药只是治疗失败的可能原因之一，并且与其他导致治疗失败的因素密切相关 因此不能孤立地看待耐药检测结果，而应将其放在病毒载量和CD4细胞计数的变化、临床表现及其他检验项目改变的背景下分析 耐药检测结果的解释必须结合既往治疗史、血浆病毒载量的长期变化及依从性的程度,AIDS的抗病毒治疗极具特殊性，包括病毒高度变异及复杂的准种、持续存在的病毒储藏库、药物种类和治疗方案多样、终生治疗不能停药、多药多方案治疗存在药物间的相互作用等 这些特点决定了耐药是HIV抗病毒治疗过程中不可避免的结果，且耐药检测方法的建立和结果的解释具有很大的复杂性和难度 尽管目前已经积累了大量关于基因型和表型解释的数据，但仍存在解释的结果与临床状况不一致的情况，迫切需要进行大量严格设计的前瞻性和回顾性临床研究，改进分析方法，更好地理解突变、耐药及治疗应答三者之间的关系,