最新：DNA甲基化和肿瘤分子标志课件-文档资料.ppt

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1、一、前言 肿瘤是严重威胁人类健康的高发病 和高死亡率性疾病，大量研究和防治资 料证实 ，早期诊断和早期治疗是防治肿 瘤与降低死亡率的最有效办法。因此， 长期以来寻找能早期诊断的肿瘤标志物 （Tumor marker，TM)成了人们关注的 焦点。 以肺癌为例，在我国肺癌是第一大 癌症，超过癌症死因的20%，且发病率 与死亡率增长迅速。肺癌的预后与诊断 是的临床分期密切相关：0期肺癌患者术 后的5年生存率可达90%以上，a可达 60%，而期病人总的5年生存率则 从40%下降到5%以下。 二、肿瘤标志与肿瘤分子标志 肿肿瘤标标志物（Tumor Marker，TM）是 指在恶性肿瘤发生和增殖过程中，由

2、肿 瘤细胞的基因表达而合成分泌的或是由 机体对肿 瘤细胞反应而异常产生和（或 ）升高的，反映肿瘤存在和生长的一类 物质，包括蛋白质、激素、酶（同工酶 ）、多胺及癌基因产物等。（中华医学会检验医 学分会肿瘤标志物专家委员会） 肿瘤分子标志 20世纪九十年代初，有文章提出 “Tumor Bio-Marker”一词，即“肿瘤生物 标志”，以后随着肿瘤分子生物学研究的 深入，国内外众多科学家称遗传 学（ genetic）和表遗传 学（Epigenetic）水 平，即基因及基因以外的分子水平（核 酸分子）的肿瘤标志为“肿瘤分子标志” 。虽然对于这些名词没有公开的确认， 但其已越来越广泛地被人们接受和应用

3、 。 三、DNA甲基化 （一）DNA甲基化与CpG岛 （二）DNA甲基化与基因表达调控 （三）DNA甲基化与肿瘤 （四）DNA甲基化肿瘤分子标志物 （五）DNA甲基化检测 方法 （一）DNA甲基化与CpG岛 1、DNA甲基化 在人类和大多数哺乳动物细胞中，基因组序 列中的CpG二核苷酸的胞嘧啶碱基（C）5位 上存在甲基化。DNA甲基化是由S-腺苷蛋氨酸 作为甲基供体，在DNA甲基转移酶催化下完成 的。甲基化是真核生物DNA的一种最常见的修 饰方式，也是一种重要的表遗传（Epigenetic ，基因型不变，而表现型改变）机制。 2、CpG岛 甲基化位点通常发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶碱 基上，在

4、哺乳动物基因组中大约70% 的CpG二核苷酸 位点是甲基化的，但CpG二核苷酸在整个基因组中的 分布是不均匀的，基因组的大部分区域CpG序列出现 频率较低，但在某些特定区域，如结构基因的5端， CpG二核苷酸以正常的频率成串排列，这种区域被称 为CpG岛。在人类基因组中大约有29000-45000个 CpG岛，占总DNA的1%左右，60%的基因（包括全 部的看家基因和40%的组织特异性表达基因）都含有 CpG岛，每一个CpG岛长度约为1-2Kb，位于基因的 5端，覆盖基因启动子及第一外显子。 CpG Methylation n CpG Island n Promoter Housekeepin

5、g gene n n 1-2kb n : Methylated CpG : Unmethylated CpG 胞嘧啶碱基的转化 3、DNA甲基化的特点 n异常甲基化(Aberrant methylation) 过甲基化 (Hypermethylation) 低甲基化 (Hypomethylation) n甲基化方式 从头甲基化(de novo methylation) 维持甲基化(maintenance methylation) （二）DNA甲基化与基因表达调控 1、DNA甲基化与印迹（imprinting）基因; 2、DNA甲基化与胚胎的正常发育; 3、DNA甲基化与雌性个体X染色体失活;

6、4、DNA甲基化与基因转录 失活. DNA甲基化 抑制转录的机制 （三）DNA甲基化与肿瘤 1、DNA甲基化、基因突变与肿瘤; 2、甲基化不足与肿瘤; 3、抑癌基因过甲基化与肿瘤. TSG（tumour suppressor gene)的过甲基化 被认为是导致其表达失活的第三条途径。 Kundons假说认为 一个抑癌基因完全失活需要 两次打击，这个假说几乎在所有的人类肿瘤中 被证明基本正确。长期以来，认为抑癌基因失活 有两条途径：基因突变和染色体物质丢失（杂合 性丢失LOH或等位基因丢失），近年来的研究显 示，甲基化是TSG失活的第三条机制，而且在某 些情况下是抑癌基因失活的唯一机制。 目前的

7、研究集中在以下3类基因: 抑癌基因：Rb、VHL、p16、p15、p14、p53、 p73、BRCA1、APC、FHIT、RAR-2、 RASSF1A； DNA损伤修复基因：MGMT和hMLH1； 肿瘤分子侵袭转移相关基因：E-cadherin、 DAPK、 TIMP3 代谢酶基因：GSTP1 这些基因涉及细胞间信号转导、细胞周期调 控、凋亡、DNA损伤修复及肿瘤的侵袭转移等 过 程。几乎所有的人类肿瘤中都存在肿瘤相关基因 的异常甲基化。 DNA过甲基化与肿瘤 (四）DNA过甲基化肿瘤分子标志物 如前所述，基因启动子过甲基化的本质是一种DNA分 子异常，与肿瘤的发生发展关系密切，特别是肿瘤抑制

8、基 因的过甲基化是导致其转录失活的一个重要原因。这种甲 基化比其它各种类型的DNA分子异常（如基因点突变、基 因缺失、微卫星序列改变、基因异常扩增及染色体异常等 ）都更加广泛地存在于几乎所有种类的肿瘤中。许多研究 显示启动子异常甲基化在许多肿瘤的发生过程中是一个 频发的早期事件，因此肿瘤相关基因的甲基化状态是肿瘤 发生的一个早期敏感指标，被认为是一种有前景的肿瘤分 子生物标志物. 1、CpG岛异常甲基化 是肿瘤的发生过程 中是一个频发的早期事件（early event) 许多基础研究证实肿 瘤相关基因启动子 的过甲基化发生细胞癌变的早期,在肿瘤的发 生过程中是一个频发的早期事件. 这种甲基化广

9、泛地存在于几乎所有种类的 肿瘤中。 2、CpG岛异常甲基化 作为肿瘤标志物的优点 （1）样品多样化且容易获得 癌变细胞可以释放DNA到外周血中，肿瘤 患者外周血中游离DNA（free DNA)的含量比 正常人中高4倍.研究发现外周血血浆/血清、 肿瘤累积器官相关的体液（如唾液、痰、尿液 及支气管灌洗液等）中同样可以检测到肿瘤 组织中存在的肿瘤相关基因的启动子异常甲 基化。这些生物样品比较容易获得，因此检 测其中某些肿瘤相关基因的甲基化状态，可以 为肿瘤的早期诊断提供非常有价值的信息。 （2）较其它类型的肿瘤分子标记物更易检测 如检测点突变，即便是同一个基因，在不同 肿瘤中甚至同类肿瘤的不同个体

10、中，发生突变的 位点也常常不同，以现有技术要全部检测非常困 难。然而某一基因在不同类型肿瘤中，其启动子 异常甲基化的区域是相同的，检测比较方便；另 外与等位基因缺失这样的标志物相比，异常甲基 化是一个阳性信号，很容易与正常组织中的阴性 背景区分。 （3）特异性与灵敏度 肿瘤的发生是一个多步骤多因素参与的复杂生物学过 程，涉及到许多基因的异常，如癌基因的激活以及抑癌基 因的失活等，是多种遗传变 异的积累所致。对于绝大多 数肿瘤，这些基因都是肿瘤相关性的，而非肿瘤特异性 的。虽然不同种类的肿瘤中可能都存在某一基因的异常甲 基化，但是不同类型的肿瘤中不同基因的甲基化发生频 率是不同的，存在着明显的基

11、因肿瘤类型相关性，每种 肿瘤都有一个独特的基因甲基化谱。因此在以基因启动子 的异常甲基化作为肿瘤发生的生物标志物时，应首先了 解一些关键基因在各种肿瘤中的甲基化情况，然后在多种 候选基因中优化选择34种相关程度高的基因，检测其 甲基化状态。这样可以做到在检测较 少指标的同时保持 标志物的敏感性和特异性。 灵敏度问题 指标本身的敏感性 检测方法的敏感性 不同类型肿瘤中相关基因的甲基化情况 肿瘤类型 候选基因 结肠癌 p16,p14,MGMT,APC 肺癌 p16,DAPK,MGMT,GSTP1 乳腺癌 p16,GSTP1,BRCA1,CDH1 白血病 p73,p15 ,DAPK,CDH1 肾癌

12、VHL,p16,GSTP1,TIMP-3 宫颈癌 p16, APC, HIC-1, DAPK, MGMT,CDH1 食管癌 RASSF1A, RAR-2, DAPK, p16 胃癌 DAPK, CDH1, GSTP1, p15, p16 不同类型肿瘤与基因甲基化 每一类型的肿瘤中都同时存在着多种肿瘤相关基 因的异常甲基化，而且不同部位的肿瘤组织中，各种 基因的甲基化发生频率是不同的，存在着明显的基因 肿瘤类型相关性。 1、胃肠道肿瘤（如结肠癌、胃癌等）中p16INK4a、 p14ARF、MGMT、APC和hMLH1基因的甲基化比率较 高； 2、呼吸系统肿瘤（肺癌、头颈部癌）中p16INK4a、

13、 DAPK、MGMT基因的甲基化较常见； 3、乳腺癌、卵巢癌中p16INK4a、GSTP1、BRCA1、 CDH1等基因启动子异常甲基化较为频 繁； 4、而恶性血液系统疾病中基因异常甲基化的情况与其它 实体瘤明显不同，这些肿瘤中p73、p15的异常甲基化 频繁，这两种基因的异常甲基化在其他肿瘤中则很少 见。 存在的问题 特异性 更适于高危人群的筛查 五、DNA甲基化检测方法 1、甲基化敏感的限制性内切酶法（MSREs) 2、限制酶-PCR法(MSREsPCR) 3、基因组直接测序法 4、HSO3-修饰基因组测序法 5、甲基化特异性PCR法（MSP) 6、结合HSO3-限制性分析法（COBRA)

14、 7、甲基化敏感的单核苷酸引物法（Ms-SNuPE) 8、荧光定量PCR(Methylight) 9、变性高效液相色谱法（DHPLC) 1、甲基化敏感的限制性内切酶法（MSREs) 该法是利用对m5C敏感的限制性核酸内切酶酶切 基因组DNA，当酶切位点处发生甲基化时，该内切酶 不能切断DNA双链；当酶切位点处未发生甲基化时， DNA双链被切断。然后经凝胶电泳检测酶切结果，判 断该位点的甲基化情况。 优点:简便、快捷。 缺点:仅能检测甲基化敏感的限制性内切酶酶切位点处 的胞嘧啶的甲基化，而不能反映整个CpG岛的甲 基化状态;酶切不完全导致假阳性。 2、限制酶-PCR法(MSREsPCR) 该法在

15、方法1的基础上结合PCR技术，提高了检测 的灵敏度。先用甲基化敏感性内切酶切割DNA，然后 用位于限制性位点侧翼的特异性引物进行PCR扩增， 该引物仅能扩增因甲基化而免于切割的DNA片段，但 不能扩增未甲基化而被切断的片段。 优点:灵敏度有所提高,定性检测只需0.6ngDNA。 缺点:DNA必须酶切完全，否则易产生假阳性;而且同 样只能检测酶切位点处的胞嘧啶的甲基化,仅能分 析所有甲基化位点的6%左右。 3、基因组直接测序法 此方法是基于m5C在标准的Maxam-Gilbert胞嘧啶 化学裂解反应（N2H4/哌啶法）中不被裂解，故m5C可 通过在测序胶上缺少对应于胞嘧啶降解反应产物的一 条带而

16、得以鉴定，如果采用MnO4 /哌啶法法则相反， 经比较可以确定甲基化的胞嘧啶。 优点:该法克服了限制性内切酶法的缺陷; 缺点:比较繁琐，测序胶上的任何背景或相距很近的条 带均可导致解释上的困难，另外该法不能用于少 量或混合DNA样品的分析,DNA的需求量（2 5g ）。 4、HSO3-基因组测序法 本法的基本原理是依据单链DNA在HSO3-存在的条 件下，能有效地将C变成U，而m5C保持不变。随后用 两对特异性引物分别扩增两条修饰后的单链，然后进 行PCR产物测序，未甲基化的胞嘧啶经修饰扩增后的 产物是T，而甲基化的C经修饰扩增后仍然是C。 优点:容易确定基因组DNA分子中各个单链的甲基化状

17、态，可以确定各甲基化的准确位点; 缺点:需要较大量的DNA(2-5微克)，操作比较繁琐。 NH2 NH2 N HSO3- H+N O N OH- O N SO3- 胞嘧啶 6-磺酸胞嘧啶 H2O NH4+ O O HN HSO3- HN O OH- O SO3 HN HN 尿嘧啶 6-磺酸尿嘧啶 5、甲基化特异性PCR法（Methylation-specific PCR,MSP) 基于HSO3-修饰后甲基化与非甲基化CpG的序列差 异,可以分别设计两对特异性引物，经PCR扩增，凝胶 电泳检测，即可区分甲基化与非甲基化DNA。 优点:灵敏度高(50ng)，能用于石蜡包埋组织及血清等 体液中DNA

18、的甲基化；操作相对简便。 缺点:若HSO3-处理不彻底，易导致假阳性；MSP法是 以引物中所有CpG位点胞嘧啶完全甲基化为前提 的，而事实上甲基化的CpG岛中却并非每个CpG 位点都完全甲基化，所以，MSP法常常存在目标 片段难扩增的问题。 MSP法原理 Denaturation of Genomic DNA; Bisulfite Modification; PCR Amplification; Denaturation and Modification CG CG UG UG ( Methylation) ( Unmethylation) PCR primer-M primer-U CG C

19、G UG UG Gel electrophoresis 6、结合HSO3-限制性分析法（COBRA) 该法首先用HSO3-处理基因组DNA，然后PCR扩增 待检测含CpG位点的序列，由于HSO3-处理引起的序列 改变可导致新的甲基化限制性酶切位点的产生或可引 起原来已存在的酶切位点如BstU的丢失，故原始 DNA甲基化水平可通过消化的与未消化的PCR产物的 相对数量来表示。 优点:快速的、灵敏的半定量方法; 缺点:定量信息依赖于限制性内切酶的完全消化，且甲 基化分析也受DNA中限制性酶切位点的限制,能满 足上述要求的位点非常有限。 7、甲基化敏感的单核苷酸引物法（Ms-SNuPE) 基因组DN

20、A经处理后,未甲基化的CU，U在随后的PCR 中象T一样被复制；而5mC则保持不变，在PCR中象C一样被 复制。PCR产物经凝胶电泳分离后，同合适的SNuPE引物、 Taq聚合酶和32P-dCTP以及32P-dTTP一起孵育后，在进行变性 PAGE和放射自显影分析，这样就很容易地对某个特定的CpG 位点中甲基化与非甲基化的C的原始状态比例进行定量分析 。 优点:灵敏、半定量分析； 缺点:操作十分繁琐，既要凝胶电泳分离，又要进行放射性 标记。 8、PCRRFLP法 用HSO3-处理基因组DNA，处理后的DNA的PCR产 物中限制性酶切位点改变，从而可用于那些不需要对 序列中特定区域内每个CpG岛

21、甲基化进行快速分析。 优点是操作简便；缺点是仅能分析25%的甲基化位点 。 9、 HSO3-PCRSSCP：操作繁琐，分辨率不高。 10、荧光定量PCR(Methylight)：灵敏、准确；但需专门 仪器，检测费用昂贵。 11、变性高效液相色谱法（DHPLC)：仅能检测扩增区域 内的甲基化总量，不能对甲基化的CpG位点精确定位 。 第二部分：巢式甲基化特异性 PCR检 测DNA甲基化 一、目的 目前用于检测DNA甲基化的最常用方法是甲基化特 异性PCR法（MSP），但在检测血清等样品时，由于 DNA含量低，方法灵敏度有待提高。本研究将巢式 PCR用于甲基化分析，建立巢式甲基化特异性聚合酶 链式

22、反应（nMSP）法，探讨了最佳PCR扩增条件，并 用该法分析了新鲜癌组织、石腊包埋组织及肿瘤患者 血清中p16基因启动子的甲基化状态。 二、方法 1、DNA提取： 新鲜癌组织、石蜡包埋组织及血清样品DNA提取。 2、基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰： 碱变性； 硫化与脱氨； 纯化与脱硫；沉淀回收DNA 。 3、巢式PCR扩增 （1）引物设计：引物设计是以亚硫酸氢盐修饰后的基 因组DNA为模板，外侧引物序列不包含CpG位点，故 可同时扩增甲基化及非甲基化目的片段；内侧引物包 含CpG位点，分别为甲基化及非甲基化特异性的。 （2）第一次扩增：同时扩增甲基化及非甲基化目的 片段，产物长280bp。 （3

23、）将第一轮PCR产物适当稀释（50倍），取10l 进行第二轮PCR反应 。 （4）以正常人外周血淋巴细胞（PBL）DNA作阴性对 照，以水作空白对照。人移行细胞膀胱癌细胞株（T- 24）的p16基因启动区是高度甲基化的，故以T-24细胞 DNA作为阳性对照。 （5）同时用MSP法检测肿瘤患者血清样品中p16基因 的甲基化。 （6）凝胶电泳分析。 三、结果 1、nMSP法检测结果 T T S N P H2O MK M U M U M U M U M U M U 2、nMSP法与MSP法的检测结果比较 分别用MSP和nMSP法检测了34例非小细胞肺癌患 者的血清中p16基因的甲基化状态，MSP和n

24、MSP法甲 基化检出率分别为53(18/34)和74(25/34) (P0.05,2test)。7例MSP法检测为非甲基化的血清 标本7例MSP法检测为非甲基化的血清标本经nMSP法 扩增出了甲基化的DNA片段. C1 P C2 H2O MK 3、阳性样品测序结果 .3-GCAGGAGGTCTCAGCGGGCGGTAGGGGACGAGGGCGACGTCTGGGAGATGGGTGGACCTAGC-5 .3-GCAGGAGGTTTTAGCGGGCGGTAGGGGATGAGGGCGATGTTTGGGAGATGGGTGGATTTAGC-5 .5-CGTCCTCCAAAATCGCCCGCCATCCCCT

25、ACTCCCGCTACAAACCCTCTACCCACCTAAATCG-3 四、结论 1、巢式甲基化特异性PCR（nMSP)是一种灵敏度高、特 异性强的甲基化检测方法，可广泛应用于不同类型标 本基因启动子甲基化分析。 2、利用巢式甲基化特异性PCR（nMSP）法可用于检测 外周血血清中肿瘤相关基因的甲基化状态 。 3、nMSP法比MSP法具有更高的灵敏度。 第三部分：建立一种DNA甲基 化的定量分析方法 一、目的 建立一种基于错配杂交和化学发光检测的 DNA甲基化定量分析方法。 二、原理 1、Denaturation of Genomic DNA; 2、Bisulfite Modificatio

26、n; 3、PCR Amplification; 4、Hybridization; 5、Detection. Genomic DNA(M and U) Denature and modification CG UG PCR amplification (Biotinylated primer without CpGs) B CG B TG GC AC Hybridization SPA B CG SPA B TG GC AC Dig Dig Detection HRP-anti-Dig HRP-anti-Dig Substrate Substrate 三、方法 1 、细胞培养、脱甲基化处理及DN

27、A、RNA的 提取 人移行膀胱癌细胞株 (T-24)、人肺腺癌细胞株 (SPC- A1), 人移行膀胱癌细胞株(BIU-87)、人肝母细胞瘤细胞 株 (Hep-G2) ，用Trizol总RNA提取试剂盒提取RNA和 DNA，以甲醛凝胶电泳检测提取RNA完整性。同时提 取DNA，紫外分光光度法测定浓度和纯度。 2、外周血白细胞DNA提取 按照参考文献采用盐析法提取 3 、用SssI处理正常人外周血白细胞DNA 4 、基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰 5 、引物设计与PCR扩增 上游引物： 5-Biotin-GAA GAA AGA GGA GGG GTT GG-3; 下游引物：5- CTA CAA A

28、CC CTC TAC CCA CC -3， 扩增产物长度为280bp。 从GenBank检索到p16基因序列（GenBank accession no.AF527803,19501-20701），设计引物时应以亚硫 酸氢盐修饰后的DNA为模板 (CT)。引物序列：上游 引物（19883-19902），下游引物（20136-20155）。 扩增参数：95热启动10分钟，加入1.0U TaqDNA聚合酶，于95 、60、72各30s循环30次，最后于72延伸6分钟。以正常 人外周血淋巴细胞（PBL）DNA作阴性对照，以重蒸水作空白对 照。以SssI处理的正常人外周血白细胞DNA作为阳性对照。 6、

29、探针设计 根据5中PCR扩增产物的序列，针对特定CpG位点设计 合成两条地高辛标记的寡核苷酸探针，两条探针有3处碱 基差异( 对应3个CpG位点),分别与甲基化和非甲基化序 列互补（应避免非特异的同源序列）。寡核苷酸探针序 列为： 5-Dig-TCGACCTCCGACCGTAAC -3（Pm） 5-Dig-TCAACCTCCAACCATAAC -3（Pu） 7、杂交(Hybridization); 8、化学发光检测(Detection); 9、PCR产物测序(Sequencing); 10、甲基化特异性PCR(MSP); 11、 RT-PCR检测肿瘤细胞p16基因的表达 细胞经5-Aza-Cd

30、R处理后,用Trizol试剂盒提取细胞总 RNA。取2ug总RNA进行逆转录。再以cDNA为模板扩 增p16基因，并同时扩增-actin为内参。 p16基因引物序列： 上游序列：5-AGCCTTCGGCTGACTGGCTGG-3； 下游引物：5-GGCCCATCATCATGACCTGG-3， -actin的引物序列： 上游序列：5-CACCCCCACTGAAAAAGATGA -3； 下游引物：5-CATCTTCAAACCTCCATGACG -3, nPCR反应条件：94 变性6min，94 1min，62 30s ，72 50s，34个循环，72 延伸7min。取扩增产物 于2%琼脂糖凝胶中电

31、泳，凝胶成像分析系统。 三、结果 1、PCR扩增结果及MSP bp MK T P N H2O T N P H2O bp MK M U M U M U M U 2、 Luminol-H2O2-HRP发光体系反应动力学 3、发光体系的线性范围及检测限 当PCR产物的量为1.2510-30.1 pmol时，回归方 程为y=576548.2X+ 12016，相关系数r=0.994；PCR 产物的量为0.110.0pmol时，回归方程为 y=4258985X +97950，相关系数r=0.998，检测限为 2.510-4pmol 。分别取5l甲基化和非甲基化PCR产物 按上述方法各测定10次，变异系数(

32、CV) 分别为5.2%和 6.4%。 4、杂交温度的选择 对于寡核苷酸探针来说，单个碱基的错配即能使解链 温度Tm值显著降低，降低杂交体的稳定性，本方法中 使用的两根探针中有3个错配位点，因此选择合适的杂 交温度可以有效地降低本底值，提高杂交特异性。将 两条探针分别与它们的互补序列及非互补序列在42 、46、48、50及52条件下杂交，然后检测 RLU，结果显示在48时，两条探针(Pm、Pu)与各自的 互补PCR产物杂交后产生的发光值相当，而与其非互 补序列已难以形成稳定的杂交体，其相对发光值（ RLU）与空白管相当，对测定结果无影响。 n5、测定混合DNA样品中甲基化百分率 为了验证方法的准

33、确性，将等摩尔浓度的甲基化p16 DNA (来源于T-24细胞DNA) 和非甲基化p16 DNA 以不同 的比例物 (10，31，11，13，01)混合，然后经 亚硫酸氢钠修饰，并按上述方法检测样品中p16基因的甲 基化百分率。将检测结果与理论值作图，由图可见本方法 的检测结果与理论值完全相符。 6、检测肿瘤细胞株p16基因甲基化程度与表达水平 采用上述方法检测了经脱甲基化试剂5-Aza-CdR 处理 前后肿瘤细胞的p16基因的甲基化程度（MI），同时用 RT-PCR检测了p16基因的转录水平。肿瘤细胞株中p16基 因的甲基化程度与其表达水平呈逆相关。 四、结论 本文建立了一种基于错配杂交-化

34、学发光检测的p16基 因启动子区特定CpG位点过甲基化的定量分析方法。可用 于定量检测外周血血清/血浆中p16基因启动子区的异常甲 基化，此外本方法还可用于肿瘤治疗效果的评价、预后观 察、肿瘤复发的监测、高危人群的筛查以及其它的甲基化 有关的实验研究。 第四部分 p16基因CpG岛过甲基化 与其转录失活的研究 一、目的 本文利用甲基化特异性PCR(MSP)、RT-PCR以及 本研究小组建立的DNA甲基化的定量检测方法研究了 四株肿瘤细胞 (T-24、SPC-A1、BIU-87、Hep-G2) 的 p16基因的甲基化状态，以及经过脱甲基化试剂5-氮杂 胞苷（ 5-Aza-CdR）处理前后p16基

35、因表达水平的变化 ，比较、探讨了四株细胞甲基化程度对其表达失活的 影响。 二、方法 1 、细胞培养、脱甲基化处理及DNA、RNA的提取。 2、外周血白细胞DNA提取。 3、 基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰。 4、甲基化特异性PCR（MSP）定性检测肿瘤细胞p16基因 甲基化。 5、利用本文建立的甲基化定量检测方法定量分析脱甲基 化处理前后甲基化程度的改变。 6、RT-PCR法检测脱甲基化处理前后p16基因表达水平的 变化。 三、结果 n1、MSP法检测结果（脱甲基化处理前及处理后） n2、RT-PCR检测脱甲基化处理前后p16基因表达水平 3、定量检测脱甲基化处理前后甲基化程度（MI）变化 n

36、SPC-A1 Hep-G2 T-24 BIU-87 n Methylation (untreated) 64 36 98 n index (%) (treated) 11 7 10 n P16/-actin (untreated) 0.480.05 0.590.04 0 n (treated) 0.860.03 0.920.05 0.580.03 n 四、结论 n本实验研究了肿瘤细胞株T-24、SPC-A1、BIU-87、 Hep-G2的甲基化状态及其表达，其中SPC-A1、BIU-87 尚未见报道。BIU-87在用5-Aza-CdR处理前后通过MSP 都未有目的条带扩增出，通过RT-PCR也

37、未见p16基因 的表达，在BIU-87中可能是存在p16基因的缺失。其它 三种细胞通过MSP显示都有不同程度的甲基化，其中 T24甲基化程度最高，因为在用p16M、p16U两对引物 扩增过程中，只有p16M有目的条带，显示了该株肿瘤 细胞p16基因CpG岛发生了完全程度的甲基化。另外两 种细胞株SPC-A1，Hep-G2用p16M和p16U都有目的条 带扩增出来，显示这两种细胞株的p16基因CpG岛存在 不同程度的甲基化。 n用RT-PCR检测四种肿瘤细胞P16基因的表达，除BIU- 87外，其它三株肿瘤细胞在用5-Aza-CdR处理后比处 理前P16基因表达有了显著升高，甲基化程度的高低与

38、转录产物呈明显的逆相关。同时形态学观察上也发现 用5-Aza-CdR处理后通过脱甲基化使细胞增殖明显减缓 ，倍增时间明显延长。 第五部分 定量检测非小细胞肺癌病人血清 中p16基因过甲基化 一、目的 肿瘤相关基因的甲基化状态是肿瘤发生的一个早 期敏感指标，是一种有前景的肿瘤分子标志物（ biomarker）。特别是由于肿瘤细胞可以释放大量游离 DNA到外周血、肿瘤累及器官相关的体液（如唾液、 痰等）中，因此痰、外周血等无创或微创样品都可以 作为检测异常甲基化的标本，这将给检测带来极大的 便利。本研究旨在通过筛选与肺癌相关性高的肿瘤相 关基因（p16基因），定性、定量检测它们在外周血血 清中的甲

39、基化状态，探讨基因启动子区过甲基化在肺 癌早期诊断中的应用。 二、方法 1 、血清中游离DNA的提取。 2、正常人外周血白细胞DNA提取。 3、 基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰。 4、甲基化特异性PCR（MSP）定性检测肿瘤细胞p16基因 甲基化。 5、利用本文建立的甲基化定量检测方法定量分析脱甲基 化处理前后甲基化程度的改变。 三、结果 1、nMSP法检测结果 nMSP法肺癌组外周血血清中p16基因的甲基化阳性率为 75.8%，良性肺病变组为9.5%，两者有显著性差异（p0.01） ，在12例健康对照组中未检测到甲基化的p16基因。40例鳞癌（ SCC）与22例腺癌（ADC）p16基因的甲基化

40、阳性率分别为78 %(31/40) 和72.7% (16/22)，无显著性差异（p 0.05）。 期肺癌病人与期肺癌病人p16基因的甲基化阳性率分别为71.1% (32/45) 和88.2% (15/17)，无显著性差异（p 0.05）。 Case1 Case2 P N H2O Bp MK M U M U M U M U M U 2、错配杂交-化学发光法定量检测血清中p16基因的 过甲基化 利用本研究建立的DNA甲基化的定量分析方法检测了 47例甲基化阳性血清中p16基因的过甲基化指数（ Methylation Index，MI%），肺癌组MI为11.82.2%（ 范围1.3615.5%），良

41、性肺病变组为0.30.15% (范围 0.150.47%)，两者有显著性差异（p0.01），在12例 健康对照组中未检测到甲基化的p16基因。本法检测结果 与MSP法检测结果显著相关(p0.005)。31例阳性鳞癌（ SCC）与16例阳性腺癌（ADC）p16基因的MI分别为 12.45.6%和10.63.8%，无显著性差异（p 0.05）。 期肺癌病人与期肺癌病人p16基因的甲基化阳性 率分别为71.1% (32/45) 和88.2% (15/17)，无显著性差异 （p 0.05）。 nTableDetection p16 methylation by nMSP and Bis-CL in s

42、erum from NSCLC . Total nMSP Bis-CLa Group of number Mb Ub rate (%) n MI (%)c Overall Lung Cancer 62 47 15 47/62(75.8) 47 11.82.2d Benign lung diease 23 2 21 3/23(9.5) 2 0.30.15 Healthy control 12 0 12 0/12 (0) Histological type SCC 40 31 9 31/40(78) 31 12.45.6 ADC 22 16 6 16/22(72.7) 16 10.63.8 TNM

43、 Stage 45 32 13 32/45(71.1) 32 11.34.7 17 15 2 15/17(88.2) 15 12.86.6 a The quantitative analysis technique based on mismatch hybridization and chemilumiscence. b The number of p16 methylated cases(M) and unmethylated cases(U). c Methylation Index (%). dxs 四、结论 本文将nMSP法及本研究建立的DNA甲基化的定量检 测方法用于检测非小细胞肺

44、癌（NCSLC）病人血清中 p16基因甲基化检测，并比较了肺癌不同组织细胞类型 、不同TNM分期之间甲基化的差异；而且用定量方法 的检测结果与nMSP法结果高度相关。本研究中，由于 样品的收集遇到较多困难，未能收集到被检肺癌患者 在手术或放、化疗后的血液标本，若能同时收集到治 疗前后的血液标本，分别检测治疗前后的甲基化水平 ，将为肿瘤的治疗、预后判断等提供大量有价值的信 息。 论文总结（主要内容与创新点 ） 1、将巢式PCR技术应用于DNA甲基化的检测，用 改进的巢式甲基化特异性PCR法检测了肿瘤组织、 石蜡包埋组织及肿瘤患者血清中p16基因的甲基化 状态。与传统的MSP法相比，改进的巢式甲基化特 异性PCR法（nMSP）具有更高的灵敏度与特异性 ； 2、建立了一种基于错配杂交、增强化学发光检测的 DNA甲基化定量分析方法，可广泛用于肿瘤相关基 因的甲基化程度分析； 3、利用RT-PCR技术及新建立的甲基化定量检 测方法研究了4株肿瘤细胞在脱甲基试剂处理前 后p16基因转录表达水平的变化以及p16基因甲基 化程度的改变，探讨了p16基因转录失活与DNA 过甲基化之间的关系，进一步证实p16基因的过 甲基化是导致其转录失活的重要方式； 4、利用新建立的甲基化定量检测方法研究了非小 细胞肺癌患者外周血血清中p16基因的甲基化状 态，探讨了p16基因的过甲基化在肿瘤的早期诊