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1、培 养 板,常用玻璃器皿清洗 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干,清洁液的配制,HeLa 是Henrietta Lacks的简称，Henrietta Lacks 是一位患有子宫颈癌的美国妇女的名字，在她死后，该细胞走被广泛散发到各研究机构，并无限次地繁殖分裂下去。,细胞培养的甚本概念,传代 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。,培养细胞的特性,贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不
2、需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。,每代贴附生长细胞的生长过程,游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）,游离期,细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10分钟一4小时,贴壁期 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）,潜伏期 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。,对数生长期：
3、 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。,停止期（平台期） 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性,培养细胞生长的条件,1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒,CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 保持培养箱内空气干净。定期消毒 （90 ，14 h)。 箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱
4、内湿度，避兔培养液蒸发。,细胞传代方法,根据细胞生长的恃点，传代方法有3种 1悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2.悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3.贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,2 细胞培养用液的配制 D-Hanks原液试剂配方 氯化钠 80.0g 磷酸氢二钠（Na HPO 2H O） 0.6g 氯化钾
5、 4.0g 磷酸二氢钾 0.6g 三蒸水 1000ml D-Hanks工作液试剂配方 D-Hanks原液 100ml 三蒸水 896ml 0.5% 酚红液 4ml,D-Hanks工作液试剂配方 D-Hanks原液 100ml 三蒸水 896ml 0.5% 酚红液 4ml,消化液： 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含
6、血清培养液终止其对细胞的消化作用,培养基,培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 易发生支原体污染,合成培养基,合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。 成本低
7、 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 各种生长因子 转移蛋白 不明成分,一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加 10血清 对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞
8、和复杂血清因子的综合反应。 在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞,无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。 1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。 无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。,向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很
9、可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。 目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清,血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌,抗菌素的使用： 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素
10、：每毫升100单位方便、广谱、稳定,完全培养基的组成,基础培养基 80一95 血清 5一20（一般加10） 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100卑位毫升,实验前的准备,培养基的配置 RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10）,消化液的配置,胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用Dhanks配置。 配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌,实验步骤,1.打开超净台，把实验中所需用具放到超净台上。 2从冰箱中取出0.25胰酶、DHanks、培养基。可以把胰酶和DH
11、anks的瓶盖打开或者拧松。 3.取待传代的细胞，用尖吸管弃去旧的培养基，加入DHanks。轻轻摇动后将Hanks弃掉。 4.用尖吸管吸取适量胰酶加入，加入的量以覆盖整个细胞培养面为宜，轻轻摇动。25分钟后迅速将消化液吸出。消化时间长短是实验成败的关键，宁可短消化，不能过消化。否则细胞会变死。在倒置显微镜下观察，当细胞质回缩，胞间间隙加大为消化适宜。,5取培养基加入细胞，反复轻轻吹打培养皿壁，制备细胞细胞悬液。吹打的部位均匀，从上到小，从左到右，顺序进行吹打，保证各个部位的培养细胞均能吹打到，成片的细胞已经分散成小的细胞团或者单细胞便停止吹打。吹打时用力不要过猛，尽量不要出现气泡，以免损伤细胞。 6至所有细胞从培养皿底部脱落下来，然后吸取至离心管中。1000 rpm离心5分钟。（无需准确计数时离心可略） 7细胞离心毕，尖吸管弃去上清，吸取培养基适量，加入离心管，将细胞重悬、吹匀。（无需准确计数时离心可略） 8吸量管吸取适量培养基1.5ml加入新的培养皿中。细胞悬液0.5ml加入新的培养皿中，培养密度为1105106/ML。显微镜下观察，摇匀，放入37度C02培养箱孵育。 9待培养基（本身为红色），当pH值降低，培养基呈偏淡红色时，一般2天以后，将旧的培养基吸掉，更换新鲜培养基继续培养。,