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1、,汇报内容,KRAS和EGFR的简介及临床意义 ARMS-PCR的基本原理和技术特点 等位特异性引物设计 KRAS试剂盒开发简介,KRAS和EGFR的简介及临床意义,KRAS背景,KRAS是一种原癌基因，长约35kb，位于12号染色体，是RAS基因家族成员之一，编码的蛋白主要参与PI3K、PTEN、AKT和RAF、MEK、ERK信号通路的调控； EGFR在通路中位于KRAS上游，配体与之结合后可以激发其酪氨酸激酶活性，导致KRAS的活化和通路中信号传导； KRAS是许多恶性肿瘤的常见突变基因：胰腺癌（65%-90%）、结直肠癌（40%）、肺癌（20%）、卵巢癌（15%）。,KRAS基因突变影响
2、结直肠癌药物疗效,KRAS基因野生型的转移性结直肠癌患者能从EGF抗体（西妥昔单抗、帕尼单抗）治疗中获益，而基因突变的患者治疗效果很差；,KRAS突变型患者对西妥昔单抗无应答，其总体生存期明显低于KRAS野生型患者,Karapetis CS, 2008, N Eng J Med,结直肠癌患者检测KRAS突变相关指南,欧洲药品评估局（EMEA，2008）指出：KRAS野生型的进展期结直肠癌患者可能从帕尼单抗中受益，而突变型患者受益较少。 美国临床肿瘤学会（ASCO，2009）推荐：转移性结直肠癌患者应检测KRAS突变，如有KRAS12、13位突变，则不应进行EGFR单克隆抗体治疗； 美国FDA指
3、南推荐：在使用靶向药物西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性结肠直肠癌前必须检测KRAS基因的基因型；2012年7月6日批准第一个用于结直肠癌的基因检测（Qiagen），以判断西妥昔单抗是否有效； 美国国立综合癌症网络（NCCN，2014）指南说：转移性结直肠癌患者均应进行RAS突变检测（KRAS和NRAS），至少应检测KRAS第二外显子的突变情况。KRAS或NRAS突变型的病人不应采取西妥昔单抗或帕尼单抗治疗。 中国卫生部于2010年10月14日发表了结直肠癌诊疗规范（2010版） 。明确指出在患者确定为复发或转移性结直肠癌接受西妥昔单抗、帕尼单抗时，必须检测肿瘤组织的K-ras基因状态。在晚期/转
4、移性结直肠癌化疗中，在治疗前检测肿瘤 K-ras 基因状态，EGFR不推荐作为常规检查项目。,KRAS基因突变影响非小细胞肺癌药物疗效,KRAS基因野生型的非小细胞肺癌患者能从小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI，如吉非替尼、厄洛替尼）治疗中获益，而基因突变的患者易发生抵抗；,KRAS突变型患者使用厄洛替尼联合化疗后，其无症状生存期和总生存期明显低于野生型患者（图中红线所示）,Anderson SM, 2011, Expert Rev. Mol. Diagn Eberhard DA, 2005, J Clin Oncol,非小细胞肺癌患者检测KRAS突变相关指南,美国国立综合癌症网络（NCCN，20
5、09）指出，KRAS突变与非小细胞肺癌患者TKI抵抗有关，KRAS基因测序有助于确定哪些病人适合TKI治疗。当KRAS基因发生了突变，则不建议病人使用厄洛替尼进行分子靶向治疗。,KRAS主要突变位点,在结直肠癌中，KRAS突变主要发生于codon12 (80%)、codon13 (15-20%)、codon61和146 (5%)；在肺癌中，约97%的KRAS突变发生于codon12、13，其余位于codon61和146。,EGFR突变背景,EGFR基因位于染色体7p11.2，大小约200kb，是上皮生长因子（EGF）细胞增殖和信号传导的受体。 EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相关信号通路中
6、关键因子的活性或细胞定位异常，与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。 非小细胞肺癌中EGFR突变率在北美和西欧为10%左右，而在东亚为30-50%。其中在亚洲、女性、非吸烟、腺癌患者中EGFR突变率最高，达70-80%。,EGFR突变背景,研究发现EGFR突变与吉非替尼、厄洛替尼的疗效密切有关。其中EGFR突变的患者对吉非替尼、厄洛替尼治疗敏感，有效率在80%以上；而EGFR野生型的患者的有效率在10%以下。 吉非替尼、厄洛替尼作为一线药物治疗非小细胞肺癌，相比传统的化疗可以取得更长的无进展生存期（PFS），且副作用相对较小，患者容易耐受，但总体生存期（OS）并未延长
7、。 EGFR-TKI目前主要用于非小细胞肺癌一线、二线和维持治疗。我国大部分医生将其用于二线（69.4%）治疗，41.7%的医生将其用于一线治疗，27.8%的医生将其作为维持治疗药物。,EGFR突变影响肺癌药物疗效,研究表明EGFR突变型患者使用吉非替尼的疗效要优于卡铂与紫杉醇组合治疗，而在野生型患者中则相反，使用吉非替尼的疗效不如卡铂与紫杉醇组合治疗。,Mok T.S. 2009, N Eng J Med Maemondo M. 2010, N Eng J Med,EGFR突变检测相关指南,美国国家综合癌症网络(NCCN)2011版的癌症治疗指南中明确指出： EGFR突变，尤其是外显子19的
8、缺失突变和外显子21的L858R突变，与肿瘤对TKIs如吉非替尼治疗敏感性有重要关系。而部分EGFR-TKI初始治疗有效的患者后期会发生耐药，与EGFR外显子20突变密切相关。 美国临床肿瘤学会（ASCO）在JCO上发表报告：EGFR-TKI是携带EGFR突变型的非小细胞肺癌病人的一线治疗药物，有益于进展期非小细胞肺癌患者的个体化治疗。 欧洲EMEA指出：易瑞沙（吉非替尼）仅对携带EGFR突变型的非小细胞肺癌患者有效，平均无进展生存期延长3.5月。 美国FDA（2013）批准对拟采用阿法替尼、厄洛替尼等EGFR-TKI治疗的患者进行EGFR突变检测的试剂盒（therascreen EGFR R
9、GQ PCR Kit和 cobas EGFR Mutation Test）； 我国非小细胞肺癌临床实践指南中也明确指出EGFR突变，尤其是19号外显子缺失突变与肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的敏感度有重要关系；对腺癌、大细胞癌、非小细胞肺癌等肺癌组织学类型，EGFR检测为一类推荐。,EGFR突变位点（常规检测29个）,EGFR突变与EGFR-TKI药物疗效关系,ADx EGFR试剂盒突变结果检测,ARMS-PCR的基本原理和技术特点,ARMS-PCR原理,ARMS是Amplification Refractory Mutation System (扩增阻碍突变系统)的缩写。 根据 PCR过
10、程中要求引物和模板间的严格互补配对来实现对突变位点的检测, 当引物 3 末端出现错配时, 产物将不能延伸。 因此设计两条上游（或下游）引物，使其3末端分别与突变位点碱基匹配和错配，共用下游（或上游）引物，分别扩增野生型和突变型目的片断。,ARMS-PCR原理,Two Allele-Specific (AS) primers, one for each allele of a SNP are designed. The AS primers contain one of two polymorphic nucleotides at the primer 3 end. Two sets of pr
11、imers, either forward or reverse primers can be designed. If a common reverse or forward primer is used in a PCR reaction, the reaction is called allele-specific PCR (AS-PCR).,You F. M. 2008, BMC Bioinformatics,PCR产物检测-Real time PCR,每个PCR循环检测荧光信号，不同PCR产物，不同荧光信号 相比凝胶电泳：更快，可定量，无PCR产物污染 信号产生方法：Scorpion
12、 (Qiagen)，双环探针(厦门艾德)，Taqman，Molecular beacons，Sybr green，Yo-pro,Figure 2 The sensitivity of QuanTAS-PCR for quantifying JAK2 mutant alleles.,Zapparoli G. V. 2013, BMC Cancer,应用于Real time-PCR的ARMS-PCR,ARMS技术特点,优点： 灵敏度高（0.1-1%） 操作简便 周期短 不产生PCR产物污染 适用样本类型多（如FFPE） 精确突变类型,缺点： 方法建立需时较长 仅能检测已知突变,测序法与ARMS法相
13、比较,操作流程及数据解读,检测流程与质量控制,标本准备,DNA抽提,突变检测,分析报告,标本种类 标本量,SOP OD 260/280 （新鲜组织） qPCR （FFPE）,SOP 阳性及阴性对照 问题及解决,SOP 报告标准 判读形式及检查,使用ARMS的KRAS突变检测试剂盒,使用ARMS的EGFR突变检测试剂盒,等位特异性引物设计,KRAS基因序列和常见突变,KRAS序列：ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAG
14、AGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG 常见突变：,三引物设计原理,You F. M. 2008, BMC Bioinformatics,三引物设计,ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCT
15、CGACACAGCAGGTCAAGAG 野生型引物（F） 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 19nt，51 突变型引物（F） 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 19nt，49 下游引物（R） 5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3 25nt，54,三引物设计下游引物设计,ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGA
16、TGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG 选择序列： 5-GACGAATATGATCCAACAATAGAGG-3 互补链： 3- CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC-5 下游引物： 5- CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC -3,3端增加错配,如果3端是弱错配（C/A或G/T）则需要引入强的错配（A/G或C/T）才可阻断3端的扩增； 如果3端是强错配（A/G或C/T）则需要引入弱的错配（C/A或G/T）或不需引入错配即可阻断3端的扩增； 当3端是中度错配（A/A，C/C，G/G 或T/T）则需要引入中度的错配。
17、 野生型引物（F） 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 突变型引物（F） 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCCT-3 下游引物（R） 5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3,四引物设计,四引物设计,ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAA
18、GAG 内引物（F） 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 内引物（R） 5-ACTCTTGCCTACGCCACC-3 外引物（F） 5-ATGACTGAATATAAACT-3 外引物（R） 5-CTCTTGACCTGCTGTGTCG-3,KRAS试剂盒开发简介,KRAS突变探针和引物设计,KRAS序列： ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGAT
19、GGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG 1. 5-CTT GTG GTA GTT GGA GCT TA-3 12GGT GAT 2. 5- AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCG GT-3 12GGT GTT 3. 5- AA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GC-3 12GGT GCT 4. 5- ATAAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT A-3 12GGT AGT 5. 5- AA CTT GTG GTA GTT GGA GCG T-3 12GGT TGT 6. 5- ATAAA CTT
20、GTG GTA GTT GGA GCC C-3 12GGT CGT 7. 5- GTG GTA GTT GGA GCT GGT AA-3 13GGC GAC 8. 参照引物：5-CT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT-3 9. 下游引物：5-ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3 TaqMan探针：5-FAM-TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-BHQ1-3 锁核酸阻滞探针(野生型)： 5-T GGA GCT GGT GGC GTA GGC-P04-3,浙江大学，CN 102367478 B,反应体系,引物终浓度：0.3 M T
21、aqman探针终浓度：0.1 M LNA阻滞探针终浓度：0.9 M Goldstarbest Taq酶终浓度：0.05 U/l 模板DNA终浓度：10-300 ng/l dNTPs终浓度：0.2 mM MgCl2 终浓度：3.5 mM,Real time-PCR循环: 95C预变性10分钟95C 15秒 60C 40秒 扩增反应40循环， 60C 40秒,ARMS-qPCR在ABI7500或LC480检测仪上进行。每个样本进行8管反应，每管反应加入共同的qPCR混合液，LNA阻滞探针及模板DNA，所不同的只有参照引物或者ARMS引物。,拟开发产品,特异性引物：7条 （检验特异性） 参照引物：1
22、条 （检验特异性） 下游引物：1条 （检验特异性） Taqman探针：1条 锁核酸阻滞探针：1条 阳性对照：包含7种突变的质粒DNA模板（测序） Taq酶，最好为Taq Gold （hot start enzyme) qPCR混合反应液,结果判读,参照引物管扩增曲线阳性，各种ARMS引物管均无扩增曲线或者其与参照引物管的扩增曲线Ct差值 10，该样本结果判断为野生型； 参照引物管扩增曲线阳性，相应ARMS引物管扩增曲线阳性，且其与参照引物管的扩增曲线Ct差值 7，该样本结果判读为可疑突变型；如重复检测3次均显示扩增曲线阳性，该样本结果判读为突变型； 参照引物管扩增曲线阴性，提示该样本提取失败，需要重新提取。,谢谢！,