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1、于是，有人设想，将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。现代的固定化酶技术已完全实现了这一设想。 高果糖浆的生产就是固定化酶技术成功地应用于工业生产的实例。,课题 3 酵母细胞的固定化,问2：面对这些实际问题，你有什么设想？,课题背景,酶是由细胞合成的，于是，又有人设想，能否将合成酶的细胞直接固定?自20世纪70年代，在固定化酶技术的基础上，又发展出了细胞固定化技术。与固定化酶技术相比，固定化细胞制备的成本更低，操作更容易。在本课题中，我们将动手制备固定化酵母细胞，体会固定化酶的作用。,课题 3 酵母细胞的固定化,问3：面对这些
2、实际问题，进一步的设想与创新？,课题背景,阅读与思考（P4950） 1、什么是高果糖浆？与蔗糖比有何优点？ 2、解决酶应用中存在不足的技术及方法是？ 3、生产高果糖浆需要什么酶？其作用是什么？ 这种酶有何特点？ 4、高果糖浆生产过程？ 5、这种方法的优点是什么？,基础知识 (一) 固定化酶的应用实例,1、高果糖浆是果糖含量为42%左右的糖浆。作为蔗糖的替代品，高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，对人的健康更有益。,3、生产高果糖浆需要葡萄糖异构酶；其作用是将葡萄糖转化为果糖；这种酶稳定性好，可持续发挥作用。,2、固定化酶技术。即将酶固定在一定空间内的技术（如固定在不溶于水的
3、载体上）,基础知识 (一)、固定化酶的应用实例,问1、什么是高果糖浆？与蔗糖比有何优点？（食品生产为什么偏向用果糖不用蔗糖？）,问2、解决酶应用中不足的技术及方法是？,问3、生产高果糖浆需什么酶？作用是什么？这种酶有何特点？,基础知识 (一) 固定化酶的应用实例,我们以高果糖浆的生产为例来了解固定化酶技术在生产实践中的应用。高果糖浆的生产需要使用葡萄糖异构酶，它能将葡萄糖转化成果糖。这种酶的稳定性好，可以持续发挥作用。但是，酶溶解于葡萄糖溶液后，就无法从糖浆中回收，造成很大的浪费。,思考： 如果你是工程技术人员，如何解决这一缺点？,固定化酶技术生产高果糖浆生产流程,基础知识 (一)、固定化酶的
4、应用实例,使用固定化酶技术，将葡萄糖异构酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触转化成果糖，从反应柱的下端流出,基础知识 (一)、固定化酶的应用实例,问4、高果糖浆生产过程？,5优点是： （1）使酶既能与反应物接触，又能与产物分离； （2）固定在载体上的 酶可以被反复利用。 反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高果糖的产量和质量。,基础知识 (一) 固定化酶的应用实例,问5、这种方法的优点是
5、什么？,使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。目前，用固定化葡萄糖异构酶生；产高果糖浆的规模已经超过了每年1000万吨。,基础知识 (一)、固定化酶的应用实例,1、下列说法不正确的是（ ） A、葡萄糖与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成 的是果糖； B、从固定化酶反应柱下端流出的
6、是果糖； C、高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿 病、龋齿和心血管病； D、酶溶解于葡萄糖溶液，可以从糖浆中回收。,2、研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的。如将从大肠杆菌得到的磷酸三酯酶固定到尼龙膜上制成制剂，可以用来降解残留在土壤中的有机磷农药，与用微生物降解相比，其作用不需要适宜的（ ） A、温度 B、PH C、水分 D、营养,问： 在生产实际中使用固定化酶技术有无不足？如有不足，怎么办?,有。一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实际中很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能进行，所以操作比较麻烦。 可采用固定化细胞技术。,基础知识 （二）固定化细胞技术,问：固定化酶或固定化
7、细胞的定义及方法？,固定化技术的定义及方法： 固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术， 包括包埋法、化学结合法(将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上)和物理吸附法。,一般来说，酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。,问：固定酶和细胞各适合采用什么方法？为什么？,基础知识 （二）固定化细胞技术,基础知识 （二）固定化细胞技术,问：固定化酶和固定化细胞常用的载体材料？,本课题使用的是包埋法固定化细胞，即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔
8、性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。本实验选用海藻酸钠作载体包埋酵母细胞 。,1、从操作角度来考虑，你认为哪一种方法更容易? 2、哪一种方法对酶活性的影响更小? 3、固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶? 4、如果想将微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应该 选择哪种方法? 5、如果反应物是大分子物质，又应该采用哪种方法?,实验操作,（一）制备固定化酵母细胞,阅读P5051思考下列问题： （1）、制备过程包括哪几个步骤？ （2）、你认为哪个步骤的操作是最重要的一环？ （3）、各步骤应当分别注意什么问题？,1酵母细胞的活化 2配制物质的量浓度为0.05 molL
9、的CaCl2溶液 3配制海藻酸钠溶液 4海藻酸钠溶液与酵母细胞混合 5固定化酵母细胞,1、酵母细胞的活化,问：什么是活化？怎样活化？应注意什么？,实验操作,（一）制备固定化酵母细胞,取1g干酵母，放入50 ml的小烧杯中，加入蒸馏水10 ml，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h左右使其活化。,活化： 就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态,注意事项 A、选用的干酵母要具有较强的活性，而且物种单一 B、在缺水状态下，微生物处于休眠状态。注意水的用量,实验操作,2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的C aCl2溶液,称取无水CaCl2 0.83g。放人200mL的烧杯
10、中，加入150mL的蒸馏水，使其充分溶解，待用。,注意事项 溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离子影响实验结果,（一）制备固定化酵母细胞,3、配制海藻酸钠溶液,实验操作,（一）制备固定化酵母细胞,称取0.7g海藻酸钠，放入50mL小烧杯中，加人10mL水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10mL。注意，加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。,说明：海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。,4、海藻酸钠溶液与酵母
11、细胞混合,将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加人已活化的醉母细胞，进行充分搅拌，使其混台均匀，再转移至注射器中,实验操作,（一）制备固定化酵母细胞,注意事项 A、溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，否则会因温度过高杀死酵母菌 B、搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察,实验操作,5、固定化酵母细胞,以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，观察液滴在CaCl2溶液中形成凝胶珠的情形。将这些凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右如果没有注射器，可以在小塑料瓶上安装一个孔径为2 mm的喷嘴来使用。,（一）制备固定化酵母细胞,注意事项 A、可利用海藻酸钠制
12、成不含酵母菌的凝胶珠，用作对照B、海藻酸钠胶体在CaCl2这种电解质的作用下，发生聚沉，形成凝胶珠，需稳定30min左右,（二）用固定化细胞发酵,1、将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗2-3次。,实验操作,（一）制备固定化酵母细胞,2、将150mL质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200mL的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25下发降24h。,注意事项,控制好发酵温度，一般是室温25,发酵时间可视具体情况而定，一般时间稍长一些，效果明显,可用不含酵母的凝胶珠做相同的处理，对照实验结果,海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要通过加热促进其溶解。溶解海藻酸钠，最好采用小火间断加热的方法。例
13、如，加热几分钟后，从石棉网上取下烧杯冷却片刻，并不断搅拌，再将烧杯放回石棉网继续加热，如此重复数次，直至海藻酸钠完全溶化。如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。,操作提示,（一）观察凝胶珠的颜色和形状 如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。 （二）观察发酵的葡萄糖溶液 利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。,1观察并描述形成的凝胶珠的颜色和形状。 2观察利用固定化酵母细胞发酵的葡萄糖溶液，看看是否有气泡产生，闻闻是否有酒味。,结果分析与评
14、价,刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。 检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。 一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。 二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。,直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点 P52,练习:,1、制备固定化酵母细胞的过程中错误的是（ ） A、取干酵母，加入蒸馏水，使其活化 B、配制海藻酸钠时，加热用大火，直到海藻酸钠溶化为止 C、将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的 酵母细胞 D、将凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右,2、下列叙述不正确的是（ ） A、从操作角度来考虑，固定化细胞比固定化酶容易 B、固定化细胞比固定化酶对酶的活性影响更小 C、固定化细胞固定的是一种酶 D、将微生物的发酵过程变成连续的酶反应应选择固定化 细胞技术,